I pesticidi ghjocanu un rollu cruciale in a lotta contru à a scarsità alimentaria mundiale è in a lotta contru à e malatie umane trasmesse da vettori. Tuttavia, u prublema crescente di a resistenza à i pesticidi richiede urgentemente a scuperta di novi cumposti chì miranu à bersagli sottoutilizati. I canali di u putenziale di u receptore transitoriu di l'insetti (TRPV) - Nanzhong (Nan) è inattivi (Iav) - ponu furmà canali eterologi (Nan-Iav) è localizà si in organi meccanosensoriali chì medianu u geotropismu, l'uditu è a propriocezione in l'insetti. Certi pesticidi, cum'è l'aphidopirrolidone (AP), miranu à Nan-Iav attraversu meccanismi scunnisciuti. AP hè efficace contr'à l'insetti perforanti-succhiatori (emipterani), impedendu l'alimentazione interrompendu a funzione di i filamenti. AP pò ligà si solu à Nan, ma solu Nan-Iav pò interagisce cù agonisti, cumprese a nicotinamide endogena (NAM), mustrendu cusì attività di canali. Malgradu u putenziale di Nan-Iav cum'è bersagliu insetticida, si sà pocu nantu à u so assemblaggio di canali, i siti di ligame regulatori è a regulazione dipendente da Ca2+, chì impediscenu l'ulteriore sviluppu di insetticidi. In questu studiu, a microscopia crioelettronica hè stata aduprata per determinà a struttura di Nan-Iav in l'insetti Hemiptera in u statu senza ligandu di calmodulina, è ancu cù AP è NAM à u cunfine di u duminiu citoplasmaticu di ripetizione di l'anchirina (ARD). Sorprendentemente, avemu trovu chì a proteina Nan stessa pò furmà un pentameru, chì hè stabilizatu da interazzione ARD mediate da AP. Questu studiu revela interazzione moleculare trà insetticidi è agonisti è Nan-Iav, mettendu in risaltu l'impurtanza di ARD in a funzione è l'assemblea di i canali, è esplorendu u mecanismu di regulazione di Ca2+.
In u cuntestu di u cambiamentu climaticu mundiale sempre più severu, u deterioramentu di a sicurezza alimentaria mundiale hè unu di i sfidi maiò di u XXI seculu, cù cunsequenze à cascata per a sucietà.1,2U rapportu di l'Organizazione Mondiale di a Salute nantu à u Statu di a Sicurezza Alimentare è a Nutrizione in u Mondu 2023 (SOFI) stima chì circa 2,33 miliardi di persone in u mondu soffrenu d'insicurezza alimentaria da moderata à severa, un prublema di longa data.3,4Sfurtunatamente, si stima chì u 20% à u 30% o più di i rendimenti di e culture si perdenu ogni annu per via di parassiti è patogeni, è si prevede chì u riscaldamentu climaticu aggraverà a resistenza à i parassiti è a vulnerabilità di e culture.4,5,6,7,8U sviluppu di pesticidi hè cruciale micca solu per prutege e culture da i parassiti è riduce a diffusione di agenti patogeni trasmessi da vettori, ma ancu per cumbatte e malatie umane trasmesse da vettori cum'è a frebba dengue, a malaria è a malatia di Chagas, chì sò sempre più resistenti à i pesticidi.5,9,10,11
Trà i principali bersagli di l'insetticidi neurotossichi, u canale TRPV eterotetramericu Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) rapprisenta una classa di bersagli insetticidi scuperti solu in l'ultima dicada, cumpresi l'insetticidi dispunibili cummercialmente cum'è l'imidacloprid è a piraclostrobina.12,13,14L'insetticida semisinteticu aphidopyrrolifen (AP) hè un pruduttu sviluppatu è cummercializatu di recente, u cui cumpunente principale hè l'insetticida attivu Inscalis®, chì si lega à l'AP à un livellu d'attività subnanomolare.15L'AP presenta una bassa tossicità acuta per l'impollinatori, l'insetti benefichi è altri organismi non bersagliati, è quandu hè adupratu secondu l'istruzzioni di l'etichetta, pò riduce a pressione di resistenza à altri insetticidi.16,17,18Nan è Iav sò largamente distribuiti in e spezie d'insetti, sò coespressi solu in i neuroni recettori di stiramentu cordale di l'antenne è di i membri, è sò cruciali per l'audizione, a percezione di a gravità è a propriocezione.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid è piraclostrobina stimulanu u cumplessu Nan-Iav per via di un mecanismu unicu, inibendu infine a trasduzione di u signale propriocettivu.13,16,23In l'insetti chì perforanu è succhianu (emipterani) cum'è l'afidi è e mosche bianche, a perdita di propriocezione altera a so capacità alimentaria, purtendu infine à a morte.13,24Hè interessante nutà chì l'AP mostra una alta affinità per u cumplessu Nan-Iav è una bassa affinità per Nan solu. U ligame di l'AP à Nan-Iav induce una corrente elettrica, ma u ligame à Nan solu ùn stimula micca l'attività di u canale. Iav stessu ùn si lega micca à l'AP.16Questu suggerisce chì Nan è Iav possinu ligà si per furmà diversi cumplessu di canali Nan-Iav (per esempiu, cù diversi rapporti stechiometrici o diverse disposizioni in u listessu rapportu stechiometricu) o chì AP possi ligà si à parechji siti. Inoltre, l'agonista naturale nicotinamide (NAM) si lega à Drosophila Nan-Iav cù affinità micromolare, mustrendu effetti simili à quelli di l'afidi (AP) in vitro.16,25è inibendu a ripruduzzione è l'alimentazione di l'afidi, purtendu infine à a so morte25,26Questi dati suscitanu parechje dumande. Per esempiu, ùn hè micca chjaru cumu si forma l'eterodimeru Nan-Iav, quali siti di ligame sò aduprati per modulà e piccule molecule, è cumu queste piccule molecule regulanu a funzione di u canale supprimendu a propriocezione. Inoltre, e ragioni per chì Nan stessa hè inattiva è hà una bassa affinità per l'AP, mentre chì l'eterodimeru Nan-Iav hè attivu è si lega à l'AP cù una maggiore affinità, ùn sò micca chjare. Infine, si sà pocu nantu à a regulazione dipendente da Ca2+ di a funzione Nan-Iav è cumu hè integrata in i prucessi di segnalazione neuronale.. 13,21
In questu studiu, cumbinendu a criomicroscopia elettronica, l'elettrofisiologia è e tecniche di ligame di radioligandi, avemu elucidatu l'assemblaggio di Nan-Iav è u mecanismu di u so ligame à i regulatori di piccule molecule. Inoltre, avemu rilevatu calmodulina (CaM) ligata custitutivamente à Iav è Nan pentameri stabilizzati AP. Quessi risultati furniscenu insights impurtanti nantu à a regulazione di l'ioni di calciu in i canali, l'assemblaggio di i canali è i fattori chì determinanu l'affinità di ligame di i ligandi. Ancu più impurtante, avemu cunfirmatu chì ARD ghjoca un rolu cintrali in questi prucessi. U nostru studiu di canali d'insetti cumpleti ligati à pesticidi agriculi pertinenti.27, 28, 29apre prospettive per u sviluppu di l'industria di i pesticidi, migliurendu l'efficacia è a specificità di i pesticidi, è permettendu l'applicazione di cumposti mirati à u TRPV à altre spezie per affrontà a sicurezza alimentaria mundiale è a diffusione di e malatie trasmesse da vettori.
Avemu ancu scupertu chì Nan-Iav hè regulatu da Ca2+, è u mecanismu di regulazione hè mediatu da CaM ligatu custitutivamente. Impurtantemente, sta regulazione dipendente da Ca2+ di Nav da CaM differisce significativamente da i meccanismi di regulazione di altri canali ionici (per esempiu, canali Na+ voltaggio-dipendenti è canali TRPV5/6).52,53,54,55,56,57In u canale Nav1.2, u duminiu C-terminale di CaM s'associa elicamente cù u duminiu C-terminale (CTD), è Ca2+ induce u ligame di u so duminiu N-terminale à a parte distale di u CTD.56In u canale TRPV5/6, u duminiu C-terminale di CaM si lega à CTH, è Ca2+ induce l'estensione versu l'altu di u so duminiu N-terminale in u poru, bluccendu cusì a permeabilità di i cationi.53,54Prupunemu un mudellu per a funzione regulata da Ca2+ di Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). In questu mudellu, u duminiu N-terminale di CaM si lega custitutivamente à u duminiu C-terminale (CTH) di Iav. In u statu di riposu (bassa cuncentrazione di [Ca2+]), u duminiu C-terminale di CaM interagisce cù Nan, stabilizendu a cunfurmazione ARD è prumove cusì l'apertura di u canale. U ligame di un agonista/insetticida à u canale induce l'apertura di i pori, purtendu à un afflussu di Ca2+. Ca2+ si lega tandu à CaM, pruvucendu a dissociazione di u duminiu C-terminale da l'ARD di Nan. Siccomu u bloccu di u ligame di CaM abolisce essenzialmente l'effettu inhibitoriu di Ca2+, sta dissociazione modula a mobilità ARD, pruvucendu cusì inibizione o desensibilizazione dipendente da Ca2+. A rapida ripresa di e currenti di u canale dopu l'eluzione di ioni di calciu (Fig. 4g) suggerisce chì questu mecanismu facilita risposte rapide à i signali neuronali mediati da Ca2+. Inoltre, hè statu signalatu chì a regione C-terminale di Iav, chì ferma pocu capita, ghjoca altri roli in u targeting di i canali è a regulazione attuale.21
Infine, u nostru studiu presenta a struttura à alta risoluzione di un cumplessu di canali TRP insetticida-insetticida d'impurtanza agricula - una scuperta prima scunnisciuta per noi. In particulare, avemu caratterizatu a struttura è a funzione di u canale di l'insetti in e cellule umane (HEK293S GnTi–) piuttostu chè in e cellule di l'insetti. Di fronte à a crescente resistenza à l'insetticidi è à a pressione cuntinua nantu à a sicurezza alimentaria è i patogeni, u nostru travagliu furnisce informazioni impurtanti chì faciliteranu u sviluppu di novi insetticidi per u benefiziu di a salute umana è di a sicurezza alimentaria mundiale. Studi anu dimustratu chì l'insetticidi cum'è AP sò efficaci contr'à certi parassiti quandu sò usati secondu l'istruzzioni di l'etichetta è anu una bassa tossicità acuta per l'impollinatori benefichi, dimustrendu a so sicurezza ambientale.13,16Inoltre, i testi di certi derivati AP nantu à e zanzare anu dimustratu chì perdenu eventualmente a so capacità di vulà. Capisce cumu questi cumposti modulatori si leganu à Nan-Iav faciliterà a mudificazione di i cumposti esistenti o u sviluppu di novi cumposti per più efficaci èprecisucuntrollu di i parassiti. U nostru studiu dimostra chì l'interfaccia Nan-Iav ARD hè critica micca solu per regulà l'attività di cumposti endogeni, pesticidi è Ca2+-CaM, ma ancu per l'assemblaggio di canali. Suggeremu chì interrompe l'assemblaggio di eterodimeri cù piccule molecule pò esse un approcciu unicu è promettente per u sviluppu di inibitori di canali ionici.
Di l'ottu geni ortologhi, sò stati selezziunati i geni à lunghezza cumpleta di u scarabeu marrone (Halyomorpha halys) Nanchung è Inactive, chì mostranu una eccellente stabilità in i detergenti. I geni sintetizati sò stati ottimizzati per i codoni per l'espressione umana è clonati in u vettore pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) utilizendu i siti di restrizione XhoI è EcoRI. Questu hà assicuratu chì i cloni eranu in quadru cù i tag C-terminali GFP-FLAG-10xHis è mCherry-FLAG-10xHis, chì sò tagliati da a proteasi HRC-3C (PPX), permettendu una replicazione indipendente.espressioneI primer utilizati per clonà Nanchung è Inactive in u vettore pBacMam eranu i seguenti:
L'imagine microscopiche di e particelle individuali sò state ottenute nantu à un microscopiu elettronicu à trasmissione (FEI) Titan Krios G2 equipatu cù una camera K3 è un filtru d'energia Gatan BioQuantum. U microscopiu hè statu utilizatu à 300 keV, cù un'impostazione d'energia di 20 eV, una dimensione di pixel di campione di 1,08 Å/pixel (ingrandimentu nominale di 81.000x) è un gradiente di sfocatu chì varieghja da -0,8 à -2,2 μm. A registrazione video hè stata effettuata à 40 fotogrammi per seconda utilizendu un microscopiu Latitude S (Gatan) cù una velocità di dose nominale di 25 e–px−1 s−1, un tempu di esposizione di 2,4 s è una dose totale di circa 60 e–Å−2.
A currezzione di u muvimentu induttu da u fasciu è a ponderazione di a dosa sò state realizate nantu à a pellicola utilizendu MotionCor2 in RELION 4.061. A stima di u parametru di a funzione di trasferimentu di cuntrastu (CTF) hè stata realizata in cryoSPARC utilizendu u metudu di stima CTF basatu nantu à patch62. E microfotografie cù una risoluzione di adattamentu CTF ≥4 Å sò state escluse da l'analisi successive. Tipicamente, un sottoinsieme di 500-1000 microfotografie hè statu utilizatu per a selezzione di punti in cryoSPARC, seguitu da parechji cicli di classificazione 2D dopu u filtraggio per ottene una maghjina di riferimentu chjara per a selezzione di particelle basata nantu à u mudellu. E particelle sò state poi estratte utilizendu scatule di delimitazione di 64 pixel è binning à 4 pieghe. Parechji cicli di classificazione 2D sò stati realizati per rimuovere e categurie di particelle indesiderate. U mudellu 3D iniziale hè statu ricustruitu utilizendu a ricustruzione ab initio è raffinatu utilizendu u raffinamentu non uniforme in cryoSPARC. A classificazione 3D hè stata realizata in cryoSPARC o RELION basata nantu à l'eterogeneità ARD. Nisuna eterogeneità significativa di i duminii di membrana hè stata osservata. E particelle sò state raffinate utilizendu i metudi C1 è C2; E particelle cù una risoluzione C2 più alta sò state cunsiderate simmetriche rispettu à C2 è impurtate in RELION per u raffinamentu bayesianu. E particelle sò state poi trasferite torna à cryoSPARC per u raffinamentu finale non uniforme è lucale. A risoluzione finale è u numeru di particelle sò mostrati in a Tavula 1.
Quandu si trattavanu i pentameri Nan+AP, avemu esploratu diversi metudi per migliurà a risoluzione di i duminii di membrana (in particulare a regione di i pori), cum'è a sottrazione di u signale è u mascheramentu TMD. Tuttavia, sti tentativi ùn anu micca avutu successu per via di u disordine potenzialmente estremu in a regione di i pori è di l'eterogeneità generale di u TMD. A risoluzione finale hè stata calculata utilizendu una maschera generata automaticamente da u metudu di trasfurmazione non uniforme in cryoSPARC, principalmente destinata à a regione ARD. Questu hà ottenutu una risoluzione significativamente più alta di quella di i duminii di membrana (in particulare a regione VSLD).
I mudelli iniziali de novo di e forme apo di i bug Nanchung è Inactive sò stati prima generati cù Coot63, è i mudelli di i bug Nan è Iav sò stati generati cù AlphaFold264 per identificà e regioni à bassa fiducia. A modellazione di a calmodulina era basata annantu à l'adattamenti di u corpu rigidu di i mudelli chì leganu Ca2+ è senza Ca2+ in l'accessioni PDB 4JPZ56 è 1CFD65, rispettivamente. I mudelli sò stati raffinati cù u raffinamentu sfericu per assicurà a stereochimica curretta è una bona geometria. A fosfatidilcolina, a fosfatidiletanolamina è a fosfatidilserina sò state dopu modellate cum'è densità lipidiche ben definite, è i ligandi NAM è AP sò stati piazzati in e densità currispondenti in e giunzioni strette. I fugliali di vincoli sò stati generati da a stringa SMILES di l'isoformi cù eLBOW in PHENIX66. Infine, i mudelli sò stati raffinati in u spaziu reale in PHENIX cù a ricerca di griglia lucale è a minimizazione glubale cù vincoli di struttura secundaria. U servitore MolProbity hè statu utilizatu per u raffinamentu di u mudellu è l'analisi strutturale, è l'illustrazioni sò state realizate cù PyMOL è UCSF Chimera X. 67,68,69 L'analisi di l'apertura hè stata realizata cù u servitore HOLE,70 è a mappatura di a cunservazione di sequenze hè stata realizata cù u servitore Consurf.71
L'analisi statistica hè stata realizata cù Igor Pro 6.2, Excel Office 365, è GraphPad Prism 7.0. Tutti i dati quantitativi sò presentati cum'è media ± errore standard (SEM). U test t di Student (bilaterale, senza accoppiamenti) hè statu utilizatu per paragunà dui gruppi. L'analisi di varianza à una via (ANOVA) seguita da u test post hoc di Dunnett hè stata utilizata per paragunà più gruppi. *P< 0,05, **P< 0,01, è ***PI valori < 0,001 sò stati cunsiderati statisticamente significativi secondu a distribuzione di i dati. I valori di Kd, Ki, è i so intervalli di cunfidenza asimmetrici à 95% sò stati calculati cù GraphPad Prism 10.
Per più dettagli nantu à a metodologia di u studiu, vi pregu di cunsultà u Riassuntu di u Rapportu di u Portfolio di a Natura ligatu in questu articulu.
U mudellu iniziale hè statu custruitu aduprendu i mudelli di calmodulina da e basi di dati PDB 4JPZ è 1CFD. E coordinate sò state depositate in a Protein Data Bank (PDB) sottu i numeri d'accessu 9NVN (Nan-Iav-CaM senza ligandu), 9NVO (Nan-Iav-CaM ligatu à nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM ligatu à nicotinamide è EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM ligatu à afenidolpirrolina è calciu), 9NVR (Nan-Iav-CaM ligatu à afenidolpirrolina è EDTA), è 9NVS (Nan pentameru ligatu à afenidolpirrolina). L'imagine currispundenti di criomicroscopia elettronica sò state depositate in a basa di dati di microscopia elettronica (EMDB) sottu i seguenti numeri d'accessu: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM senza ligandu), EMD-49845 (cumplessu Nan-Iav-CaM cù nicotinamide), EMD-49846 (cumplessu Nan-Iav-CaM cù nicotinamide è EDTA), EMD-49847 (cumplessu Nan-Iav-CaM cù afidopirrollina è calciu), EMD-49848 (cumplessu Nan-Iav-CaM cù afidopirrollina è EDTA), è EMD-49849 (cumplessu Nan pentameru cù afidopirrollina). I dati grezzi per l'analisi funzionale sò presentati in questu articulu.
Data di publicazione: 28 di ghjennaghju di u 2026