A droga antihelmintica N,N-dietil-m-toluamide (DEET) hè statu infurmatu per inibisce l'AChE (acetylcholinesterase) è hà potenziale proprietà carcinogeniche per via di una vascularizazione eccessiva. Dans cet article, nous montrons que le DEET stimule spécifiquement les cellules endothéliales qui favorisent l'angiogenèse, augmentant ainsi la croissance tumorale. DEET attiva i prucessi cellulari chì portanu à l'angiogenesi, cumprese a proliferazione, a migrazione è l'adesione. Questu hè assuciatu cù l'aumentu di a produzzione di NO è l'espressione di VEGF in e cellule endoteliali. U silenziu di M3 o l'usu di l'inhibitori M3 farmacològichi anu abulitu tutti questi effetti, chì suggerenu chì l'angiogenesi inducida da DEET hè M3-sensibile. Esperimenti chì implicanu a signalazione di calciu in e cellule endoteliali è HEK chì sovraesprimenu i receptori M3, è ancu studii di ubligatoriu è di docking, indicanu chì DEET agisce cum'è un modulatore allostericu di i receptori M3. Inoltre, DEET inibisce l'AChE, aumentendu cusì a biodisponibilità di l'acetilcolina è a so ligame à i receptori M3, è rinfurzendu l'effetti proangiogenici per via di a regulazione allosterica.
I EC primari sò stati isolati da l'aorta di i topi svizzeri. U metudu d'estrazione hè stata adattata da u protocolu Kobayashi 26. Murine EC sò stati cultivati in EBM-2 medium supplemented with 5% heat-inactivated FBS finu à u quartu passaghju.
L'effettu di duie concentrazioni di DEET nantu à a proliferazione di HUVEC, U87MG, o BF16F10 hè statu analizatu cù u CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). In breve, 5.103 cells per pozzu sò stati siminati in una piastra di 96 pozzi, permessu di aghjunghje per a notte, è poi trattatu cù DEET per 24 h. Dopu avè sguassatu u mediu di crescita, aghjunghje a suluzione di tintura à ogni pozzu di u microplate è incubate e cellule à 37 ° C per 30 min. I livelli di fluorescenza sò stati determinati utilizendu un lettore di micropiatti multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania) equipatu di filtri di eccitazione 485 nm è filtri di emissione 530 nm.
L'HUVEC sò stati sementi in piastre di 96 pozzi à una densità di 104 cellule per pozzu. E cellule sò state trattate cù DEET per 24 h. A viabilità cellulare hè stata valutata cù un test colorimetricu MTT (Sigma-Aldrich, M5655). I valori di densità ottica sò stati ottenuti nantu à un lettore di micropiastra multimode (Mithras LB940) à una lunghezza d'onda di 570 nm.
L'effetti di DEET sò stati studiati cù l'angiogenesi in vitro. U trattamentu cù 10-8 M o 10-5 M DEET hà aumentatu a furmazione di capillary length in HUVECs (Fig. 1a, b, bars bianchi). In cunfrontu cù u gruppu di cuntrollu, u trattamentu cù cuncentrazioni di DEET chì varieghja da 10-14 à 10-5 M hà dimustratu chì a lunghezza capillare hà righjuntu un plateau à 10-8 M DEET (Figura Supplementaria S2). Nisuna differenza significativa hè stata truvata in l'effettu proangiogenic in vitro di HUVECs trattati cù DEET in a gamma di cuncentrazione di 10-8 M è 10-5 M.
Per determinà l'effettu di DEET nantu à a neovascularizazione, avemu realizatu studii di neovascularizazione in vivo. Dopu à 14 ghjorni, i topi injected with endothelial cells precultured with 10-8 M or 10-5 M DEET mustrò un incrementu significativu di u cuntenutu di hemoglobina (Fig. 1c, bars bianchi).
Inoltre, a neovascularizazione indotta da DEET hè stata studiata in topi chì portanu xenograft U87MG chì sò stati iniettati ogni ghjornu (ip) cù DEET à una dosa cunnisciuta per induce concentrazioni di plasma di 10-5 M, chì hè normale in l'omu esposti. in 23. I tumuri detectable (ie tumuri> 100 mm3) sò stati osservati 14 ghjorni dopu l'iniezione di cellule U87MG in i topi. À u ghjornu 28, a crescita di u tumore hè stata significativamente aumentata in i topi trattati cù DEET cumparatu cù i topi di cuntrollu (Fig. 1d, squares). Inoltre, a tintura CD31 di i tumuri hà dimustratu chì DEET hà aumentatu significativamente l'area capillare, ma micca a densità di microvessel. (Fig. 1e-g).
Per determinà u rolu di i receptori muscarinici in a proliferazione indotta da DETA, 10-8 M o 10-5 M DETA in presenza di pFHHSiD (10-7 M, un antagonista di receptore M3 selettivu) hè stata utilizata. Trattamentu di HUVEC. pFHHSiD hà completamente bluccatu e proprietà proliferative di DETA à tutte e cuncentrazioni (Table 1).
In queste cundizioni, avemu ancu esaminatu se DEET aumenterà a lunghezza capillare in e cellule HUVEC. In listessu modu, pFHHSiD hà impeditu significativamente a lunghezza capillary induced DEET (Fig. 1a, b, bars grisa). Inoltre, esperimenti simili sò stati realizati cù M3 siRNA. Ancu s'è u siRNA di cuntrollu ùn era micca efficace in a prumuzione di a furmazione di capillari, u silenziu di u receptore muscarinic M3 aboliu l'abilità di DEET per aumentà a lunghezza capillary (Fig. 1a, b, bars neri).
Inoltre, i dui 10-8 M o 10-5 M DEET-induced vascularization in vitro è neovascularization in vivo sò stati completamente bluccati da pFHHSiD (Fig. 1c, d, circles). Ces résultats indiquent que le DEET favorise l'angiogenèse grâce à une voie sensible aux antagonistes sélectifs du récepteur M3 ou siRNA M3.
AChE hè u mira moleculare di DEET. Droghe cum'è donepezil, chì agiscenu cum'è inhibitori di AChE, ponu stimulà l'angiogenesi di EC in vitro è in mudelli di ischemia di i musculi posteriori14. Avemu pruvatu l'effettu di duie concentrazioni di DEET nantu à l'attività di l'enzima AChE in HUVEC. A cuncentrazione bassa (10-8 M) è alta (10-5 M) di DEET diminuite l'attività AChE endothelial in paragunà à e cundizioni di cuntrollu (Fig. 2).
E duie concentrazioni di DEET (10-8 M è 10-5 M) riduttanu l'attività di l'acetilcolinesterasi nantu à HUVEC. BW284c51 (10-5 M) hè stata utilizata com'è cuntrollu per l'inibitori di l'acetilcolinesterasi. I risultati sò spressi cum'è percentuale di l'attività AChE nantu à HUVEC trattatu cù e duie concentrazioni di DEET cumparatu cù e cellule trattate cù veiculi. I valori sò espressi cum'è una media ± SEM di sei esperimenti indipendenti. * p < 0,05 paragunatu à u cuntrollu (test di comparazione multipla di Kruskal-Wallis è Dunn).
L'ossidu nitricu (NO) hè implicatu in u prucessu angiogenicu 33, per quessa, a pruduzzioni NO in HUVEC stimulati da DEET hè stata studiata. A produzzione di NO endoteliale trattata da DEET hè stata aumentata in paragunà à e cellule di cuntrollu, ma hà righjuntu significatu solu à una dosa di 10-8 M (Fig. 3c). Per determinà i cambiamenti molecolari chì cuntrullanu a produzzione NO indotta da DEET, l'espressione è l'attivazione di eNOS sò state analizate da Western blotting. Ancu s'ellu u trattamentu DEET ùn hà micca alteratu l'espressione di eNOS, hà aumentatu significativamente a fosforilazione di eNOS in u so situ di attivazione (Ser-1177) mentre diminuì u so situ inhibitoriu (Thr-495) cumparatu cù e cellule senza trattamentu in a fosforilazione di eNOS (Fig. 3d). Inoltre, u rapportu di eNOS fosforilatu in u situ di attivazione è u situ inibitori hè statu calculatu dopu a normalizazione di a quantità di eNOS fosforilate à a quantità totale di l'enzima. Questa ratio hè stata significativamente aumentata in HUVECs trattati cù ogni cuncentrazione di DEET cumparatu cù e cellule senza trattamentu (Fig. 3d).
Infine, l'espressione di VEGF, unu di i principali fatturi proangiogenici, hè stata analizata da Western blotting. DEET hà aumentatu significativamente l'espressione di VEGF, mentri pFHHSiD hà completamente bluccatu sta espressione.
Siccomu l'effetti di DEET sò sensibili à u bloccu farmacologicu è à a downregulation di i receptori M3, avemu pruvatu l'ipotesi chì DEET puderia aumentà a signalazione di calcium. Sorprendentemente, DEET hà fallutu per aumentà u calcium cytoplasmic in HUVEC (dati micca mostrati) è HEK / M3 (Fig. 4a, b) per i dui cuncentrazioni utilizati.
Tempu di Postu: Dec-30-2024