A droga antielmintica N,N-dietil-m-toluamide (DEET) hè statu signalatu per inibisce l'AChE (acetilcolinesterasi) è hà putenziali proprietà cancerogene per via di una vascolarizazione eccessiva. In questu articulu, mostremu chì u DEET stimula specificamente e cellule endoteliali chì prumove l'angiogenesi, aumentendu cusì a crescita tumorale. U DEET attiva i prucessi cellulari chì portanu à l'angiogenesi, cumprese a proliferazione, a migrazione è l'adesione. Questu hè assuciatu à una maggiore produzione di NO è espressione di VEGF in e cellule endoteliali. U silenziamentu di M3 o l'usu di inibitori farmacologichi di M3 anu abolitu tutti questi effetti, suggerendu chì l'angiogenesi indotta da DEET hè sensibile à M3. Esperimenti chì implicanu a segnalazione di calciu in cellule endoteliali è HEK chì sovraesprimenu i recettori M3, è ancu studii di ligame è docking, indicanu chì u DEET agisce cum'è un modulatore allostericu di i recettori M3. Inoltre, u DEET inibisce l'AChE, aumentendu cusì a biodisponibilità di l'acetilcolina è u so ligame à i recettori M3, è rinfurzendu l'effetti proangiogenici per via di a regulazione allosterica.
L'EC primarie sò state isolate da l'aorta di topi svizzeri. U metudu d'estrazione hè statu adattatu da u protocolu Kobayashi 26. L'EC murine sò state cultivate in mezu EBM-2 supplementatu cù 5% FBS inattivatu da u calore finu à u quartu passaghju.
L'effettu di duie concentrazioni di DEET nantu à a proliferazione di HUVEC, U87MG, o BF16F10 hè statu analizatu cù u CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). In breve, 5.103 cellule per pozzetto sò state seminate in una piastra à 96 pozzetti, lasciate attaccà durante a notte, è poi trattate cù DEET per 24 ore. Dopu avè rimosso u mezu di crescita, aghjunghje una soluzione legante di colorante à ogni pozzetto di a micropiastra è incubate e cellule à 37 °C per 30 minuti. I livelli di fluorescenza sò stati determinati cù un lettore di micropiastre multimode Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania) equipatu cù filtri di eccitazione di 485 nm è filtri di emissione di 530 nm.
L'HUVEC sò state suminate in piastre di 96 pozzetti à una densità di 104 cellule per pozzetto. E cellule sò state trattate cù DEET per 24 ore. A viabilità cellulare hè stata valutata cù un test MTT culurimetricu (Sigma-Aldrich, M5655). I valori di densità ottica sò stati ottenuti nantu à un lettore di micropiastre multimode (Mithras LB940) à una lunghezza d'onda di 570 nm.
L'effetti di DEET sò stati studiati aduprendu testi d'angiogenesi in vitro. U trattamentu cù 10-8 M o 10-5 M DEET hà aumentatu a furmazione di lunghezza capillare in HUVEC (Fig. 1a, b, barre bianche). In paragone cù u gruppu di cuntrollu, u trattamentu cù concentrazioni di DEET chì varianu da 10-14 à 10-5 M hà dimustratu chì a lunghezza capillare hà righjuntu un plateau à 10-8 M DEET (Fig. Supplementare S2). Nisuna differenza significativa hè stata trovata in l'effettu proangiogenicu in vitro di HUVEC trattati cù DEET in l'intervallu di concentrazione di 10-8 M è 10-5 M.
Per determinà l'effettu di u DEET nantu à a neovascularizazione, avemu realizatu studii di neovascularizazione in vivo. Dopu à 14 ghjorni, i topi iniettati cù cellule endoteliali precultivate cù 10-8 M o 10-5 M DEET anu mostratu un aumentu significativu di u cuntenutu di emoglobina (Fig. 1c, barre bianche).
Inoltre, a neovascularizazione indotta da DEET hè stata studiata in topi portatori di xenotrapianti U87MG chì sò stati iniettati ogni ghjornu (ip) cù DEET à una dosa cunnisciuta per induce concentrazioni plasmatiche di 10-5 M, chì hè nurmale in l'umani esposti. in 23. I tumori rilevabili (vale à dì tumori >100 mm3) sò stati osservati 14 ghjorni dopu l'iniezione di cellule U87MG in topi. À u ghjornu 28, a crescita di u tumore hè stata significativamente aumentata in i topi trattati cù DEET paragunatu à i topi di cuntrollu (Fig. 1d, quadrati). Inoltre, a culurazione CD31 di i tumori hà dimustratu chì DEET hà aumentatu significativamente l'area capillare ma micca a densità di i microvasi. (Fig. 1e-g).
Per determinà u rolu di i receptori muscarinici in a proliferazione indotta da DETA, hè statu utilizatu 10-8 M o 10-5 M DETA in presenza di pFHHSiD (10-7 M, un antagonista selettivu di u receptore M3). Trattamentu di HUVEC. pFHHSiD hà bluccatu cumpletamente e proprietà proliferative di DETA à tutte e concentrazioni (Tabella 1).
In queste cundizioni, avemu ancu esaminatu se u DEET aumenterebbe a lunghezza capillare in e cellule HUVEC. In listessu modu, u pFHHSiD hà impeditu significativamente a lunghezza capillare indotta da DEET (Fig. 1a, b, barre grigie). Inoltre, esperimenti simili sò stati realizati cù u siRNA M3. Ancu s'è u siRNA di cuntrollu ùn era micca efficace per prumove a furmazione capillare, u silenziamentu di u receptore muscarinicu M3 hà abulitu a capacità di u DEET d'aumentà a lunghezza capillare (Fig. 1a, b, barre nere).
Inoltre, a vascolarizazione indotta da DEET 10-8 M o 10-5 M in vitro è a neovascolarizazione in vivo sò state cumpletamente bluccate da pFHHSiD (Fig. 1c, d, cerchi). Quessi risultati indicanu chì DEET prumove l'angiogenesi per via di una via sensibile à l'antagonisti selettivi di i recettori M3 o à u siRNA M3.
L'AChE hè u bersagliu moleculare di u DEET. I medicinali cum'è u donepezil, chì agiscenu cum'è inibitori di l'AChE, ponu stimulà l'angiogenesi di l'EC in vitro è in i mudelli di ischemia di l'arti posteriori di u topu14. Avemu testatu l'effettu di duie concentrazioni di DEET nantu à l'attività enzimatica AChE in HUVEC. Concentrazioni basse (10-8 M) è alte (10-5 M) di DEET anu diminuitu l'attività endoteliale di l'AChE paragunatu à e cundizioni di cuntrollu (Fig. 2).
E duie concentrazioni di DEET (10-8 M è 10-5 M) anu riduttu l'attività di l'acetilcolinesterasi nantu à l'HUVEC. BW284c51 (10-5 M) hè statu utilizatu cum'è cuntrollu per l'inibitori di l'acetilcolinesterasi. I risultati sò espressi cum'è percentuale di l'attività di l'AChE nantu à l'HUVEC trattati cù e duie concentrazioni di DEET paragunatu à e cellule trattate cù veiculu. I valori sò espressi cum'è media ± SEM di sei esperimenti indipendenti. *p < 0,05 paragunatu à u cuntrollu (test di paragone multiplu di Kruskal-Wallis è Dunn).
L'ossidu nitricu (NO) hè implicatu in u prucessu angiogenicu 33, dunque, hè stata studiata a pruduzzione di NO in HUVEC stimulati da DEET. A pruduzzione di NO endoteliale trattata cù DEET hè stata aumentata paragunata à e cellule di cuntrollu, ma hà righjuntu a significatività solu à una dosa di 10-8 M (Fig. 3c). Per determinà i cambiamenti moleculari chì cuntrolanu a pruduzzione di NO indotta da DEET, l'espressione è l'attivazione di eNOS sò state analizate per Western blotting. Ancu s'è u trattamentu cù DEET ùn hà micca alteratu l'espressione di eNOS, hà aumentatu significativamente a fosforilazione di eNOS in u so situ di attivazione (Ser-1177) mentre diminuisce u so situ inibitoriu (Thr-495) paragunata à e cellule micca trattate in a fosforilazione di eNOS (Fig. 3d). Inoltre, u rapportu di eNOS fosforilatu in u situ di attivazione è in u situ inibitoriu hè statu calculatu dopu avè nurmalizatu a quantità di eNOS fosforilatu à a quantità tutale di enzima. Stu rapportu hè statu significativamente aumentatu in HUVEC trattati cù ogni cuncentrazione di DEET paragunata à e cellule micca trattate (Fig. 3d).
Infine, l'espressione di VEGF, unu di i principali fattori proangiogenici, hè stata analizata per Western blotting. U DEET hà aumentatu significativamente l'espressione di VEGF, mentre chì u pFHHSiD hà bluccatu cumpletamente sta espressione.
Siccomu l'effetti di DEET sò sensibili à u bloccu farmacologicu è à a downregulation di i receptori M3, avemu testatu l'ipotesi chì DEET puderia aumentà a segnalazione di calciu. Sorprendentemente, DEET ùn hè micca riesciutu à aumentà u calciu citoplasmaticu in HUVEC (dati micca mostrati) è HEK/M3 (Fig. 4a, b) per e duie concentrazioni aduprate.
Data di publicazione: 30 dicembre 2024