In questu studiu, l'effetti stimulanti di u trattamentu cumminatu diregulatori di crescita di e piante(2,4-D è chinetina) è nanoparticelle d'ossidu di ferru (Fe₃O₄-NP) nantu à a morfogenesi in vitro è a pruduzzione di metaboliti secundarii in *Hypericum perforatum* L. sò stati studiati. U trattamentu ottimizatu [2,4-D (0,5 mg/L) + chinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NP (4 mg/L)] hà migliuratu significativamente i parametri di crescita di e piante: l'altezza di a pianta hè aumentata di 59,6%, a lunghezza di e radiche di 114,0%, u numeru di gemme di 180,0% è u pesu frescu di u callu di 198,3% paragunatu à u gruppu di cuntrollu. Stu trattamentu cumminatu hà ancu migliuratu l'efficienza di rigenerazione (50,85%) è hà aumentatu u cuntenutu d'ipericina di 66,6%. L'analisi GC-MS hà rivelatu un altu cuntenutu di iperoside, β-patolene è alcolu cetilicu, chì rapprisenta u 93,36% di l'area tutale di u piccu, mentre chì u cuntenutu di fenoli è flavonoidi tutali hè aumentatu finu à l'80,1%. Quessi risultati indicanu chì i regulatori di crescita di e piante (PGR) è e nanoparticelle di Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) esercenu un effettu sinergicu stimulendu l'organogenesi è l'accumulazione di cumposti bioattivi, ciò chì rapprisenta una strategia promettente per u miglioramentu biotecnologicu di e piante medicinali.
L'erba di San Ghjuvanni (Hypericum perforatum L.), cunnisciuta ancu cum'è erba di San Ghjuvanni, hè una pianta erbacea perenne di a famiglia Hypericaceae chì hà un valore ecunomicu.[1] I so cumpunenti bioattivi putenziali includenu tannini naturali, xantoni, floroglucinolo, naftalenediantrone (iperina è pseudoiperina), flavonoidi, acidi fenolici è olii essenziali.[2,3,4] L'erba di San Ghjuvanni pò esse propagata cù metudi tradiziunali; tuttavia, a stagionalità di i metudi tradiziunali, a bassa germinazione di e sementi è a suscettibilità à e malatie limitanu u so putenziale per a cultura à grande scala è a furmazione cuntinua di metaboliti secundarii.[1,5,6]
Cusì, a cultura di tessuti in vitro hè cunsiderata un metudu efficace per a propagazione rapida di e piante, a cunservazione di e risorse di germoplasma è l'aumentu di u rendimentu di cumposti medicinali [7, 8]. I regulatori di crescita di e piante (PGR) ghjocanu un rolu cruciale in a regulazione di a morfogenesi è sò necessarii per a cultura in vitro di calli è organismi interi. L'ottimizazione di e so concentrazioni è cumminazzioni hè cruciale per u cumpletamentu successu di sti prucessi di sviluppu [9]. Dunque, capisce a cumpusizione è a concentrazione adatte di i regulatori hè impurtante per migliurà a capacità di crescita è rigenerativa di l'erba di San Ghjuvanni (H. perforatum) [10].
E nanoparticule d'ossidu di ferru (Fe₃O₄) sò una classa di nanoparticule chì sò state o sò in corsu di sviluppu per a cultura tissutale. U Fe₃O₄ hà proprietà magnetiche significative, una bona biocompatibilità è a capacità di prumove a crescita di e piante è di riduce u stress ambientale, dunque hà attiratu una attenzione considerableu in i disinni di cultura tissutale. L'applicazioni potenziali di queste nanoparticule ponu include l'ottimisazione di a cultura in vitro per prumove a divisione cellulare, migliurà l'assorbimentu di nutrienti è attivà l'enzimi antioxidanti [11].
Ancu s'è e nanoparticule anu dimustratu boni effetti di prumuzione nantu à a crescita di e piante, i studii nantu à l'applicazione cumminata di nanoparticule di Fe₃O₄ è regulatori di crescita di e piante ottimizzati in *H. perforatum* restanu scarsi. Per riempie sta lacuna di cunniscenza, questu studiu hà valutatu l'effetti di i so effetti cumminati nantu à a morfogenesi in vitro è a pruduzzione di metaboliti secundarii per furnisce nuove intuizioni per migliurà e caratteristiche di e piante medicinali. Dunque, questu studiu hà dui obiettivi: (1) ottimizà a cuncentrazione di regulatori di crescita di e piante per prumove efficacemente a furmazione di calli, a rigenerazione di i germogli è u radicamentu in vitro; è (2) valutà l'effetti di e nanoparticule di Fe₃O₄ nantu à i parametri di crescita in vitro. I piani futuri includenu a valutazione di u tassu di sopravvivenza di e piante rigenerate durante l'acclimatazione (in vitro). Si prevede chì i risultati di questu studiu migliuraranu significativamente l'efficienza di micropropagazione di *H. perforatum*, cuntribuendu cusì à l'usu sustenibile è à l'applicazioni biotecnologiche di sta impurtante pianta medicinale.
In questu studiu, avemu ottenutu espianti di foglie da piante annuali di erba di San Ghjuvanni cultivate in campu (piante madri). Quessi espianti sò stati aduprati per ottimizà e cundizioni di cultura in vitro. Prima di a cultura, e foglie sò state risciacquate accuratamente sottu à acqua distillata corrente per parechji minuti. E superfici di l'espianti sò state poi disinfettate per immersione in etanolu à 70% per 30 secondi, seguita da immersione in una soluzione di ipoclorito di sodiu (NaOCl) à 1,5% chì cuntene qualchì goccia di Tween 20 per 10 minuti. Infine, l'espianti sò stati risciacquati trè volte cù acqua distillata sterile prima di trasferisceli à u prossimu mezu di cultura.
In e quattru settimane successive, i parametri di rigenerazione di i germogli sò stati misurati, cumprese a velocità di rigenerazione, u numeru di germogli per espianto è a lunghezza di i germogli. Quandu i germogli rigenerati anu righjuntu una lunghezza di almenu 2 cm, sò stati trasferiti in un mezu di radicazione custituitu da mezu MS à metà forza, 0,5 mg/L d'acidu indolebutiricu (IBA) è 0,3% di gomma di guar. A cultura di radicazione hà cuntinuatu per trè settimane, durante e quali sò stati misurati a velocità di radicazione, u numeru di radiche è a lunghezza di e radiche. Ogni trattamentu hè statu ripetutu trè volte, cù 10 espianti cultivati per replica, dendu circa 30 espianti per trattamentu.
L'altezza di a pianta hè stata misurata in centimetri (cm) cù una regula, da a basa di a pianta à a punta di a foglia più alta. A lunghezza di a radica hè stata misurata in millimetri (mm) subitu dopu avè cacciatu cù cura e piantine è u sustratu di crescita. U numeru di germogli per espianto hè statu cuntatu direttamente nantu à ogni pianta. U numeru di macchie nere nantu à e foglie, cunnisciute cum'è noduli, hè statu misuratu visivamente. Si crede chì questi noduli neri sianu ghiandole chì cuntenenu ipericina, o macchie ossidative, è sò aduprati cum'è indicatore fisiologicu di a risposta di a pianta à u trattamentu. Dopu avè cacciatu tuttu u sustratu di crescita, u pesu frescu di e piantine hè statu misuratu cù una bilancia elettronica cù una precisione di milligrammi (mg).
U metudu per calculà a velocità di furmazione di callu hè u seguente: dopu avè cultivatu espianti in un mezu chì cuntene diversi regulatori di crescita (chinasi, 2,4-D è Fe3O4) per quattru settimane, si conta u numeru di espianti capaci di furmà callu. A formula per calculà a velocità di furmazione di callu hè a seguente:
Ogni trattamentu hè statu ripetutu trè volte, cù almenu 10 espianti esaminati in ogni ripetizione.
A velocità di rigenerazione riflette a proporzione di tissutu callosu chì cumpleta cù successu u prucessu di differenziazione di e gemme dopu a fase di furmazione di u callu. Questu indicatore dimostra a capacità di u tissutu callosu di trasfurmà si in tissutu differenziatu è di cresce in novi organi vegetali.
U cuefficiente di radicamentu hè u rapportu trà u numeru di rami capaci di radicà è u numeru tutale di rami. Questu indicatore riflette u successu di a fase di radicamentu, chì hè cruciale in a micropropagazione è a propagazione di e piante, postu chì un bon radicamentu aiuta e piantine à sopravvive megliu in e cundizioni di crescita.
I cumposti d'ipericina sò stati estratti cù 90% di metanolu. Cinquanta mg di materiale vegetale seccu sò stati aghjunti à 1 ml di metanolu è sonicati per 20 minuti à 30 kHz in un pulitore à ultrasoni (mudellu A5120-3YJ) à temperatura ambiente in u bughju. Dopu a sonicazione, u campione hè statu centrifugatu à 6000 rpm per 15 minuti. U surnatante hè statu raccoltu, è l'assorbanza di l'ipericina hè stata misurata à 592 nm utilizendu un spettrofotometru Plus-3000 S secondu u metudu discrittu da Conceiçao et al. [14].
A maiò parte di i trattamenti cù regulatori di crescita di e piante (PGR) è nanoparticelle d'ossidu di ferru (Fe₃O₄-NP) ùn anu micca induttu a furmazione di noduli neri nantu à e foglie di germogli rigenerati. Nisun nodulu hè statu osservatu in alcunu di i trattamenti cù 0,5 o 1 mg/L 2,4-D, 0,5 o 1 mg/L chinetina, o 1, 2 o 4 mg/L nanoparticelle d'ossidu di ferru. Alcune cumminazzioni anu mostratu un ligeru aumentu di u sviluppu di noduli (ma micca statisticamente significativu) à concentrazioni più elevate di chinetina è/o nanoparticelle d'ossidu di ferru, cum'è a cumminazione di 2,4-D (0,5-2 mg/L) cù chinetina (1-1,5 mg/L) è nanoparticelle d'ossidu di ferru (2-4 mg/L). Quessi risultati sò mostrati in a Figura 2. I noduli neri rapprisentanu ghiandole ricche di ipericina, sia naturali sia benefiche. In questu studiu, i noduli neri eranu principalmente assuciati à l'imbrunimentu di i tessuti, indicendu un ambiente favurevule per l'accumulazione di ipericina. U trattamentu cù nanoparticule di 2,4-D, chinetina è Fe₃O₄ hà prumuvutu a crescita di u callu, hà riduttu l'imbrunimentu è hà aumentatu u cuntenutu di clorofilla, suggerendu una funzione metabolica migliorata è una putenziale riduzione di u dannu ossidativu [37]. Questu studiu hà valutatu l'effetti di a chinetina in cumbinazione cù nanoparticule di 2,4-D è Fe₃O₄ nantu à a crescita è u sviluppu di u callu di l'erba di San Ghjuvanni (Fig. 3a-g). Studi precedenti anu dimustratu chì e nanoparticule di Fe₃O₄ anu attività antifungine è antimicrobiche [38, 39] è, quandu sò aduprate in cumbinazione cù regulatori di crescita di e piante, ponu stimulà i meccanismi di difesa di e piante è riduce l'indici di stress cellulare [18]. Ancu s'è a biosintesi di i metaboliti secundarii hè regulata geneticamente, u so rendimentu attuale dipende assai da e cundizioni ambientali. I cambiamenti metabolichi è morfologichi ponu influenzà i livelli di metaboliti secundarii regulendu l'espressione di geni vegetali specifici è rispondendu à fattori ambientali. Inoltre, l'induttori ponu scatenà l'attivazione di novi geni, chì à u so tornu stimulanu l'attività enzimatica, attivendu infine parechje vie biosintetiche è purtendu à a furmazione di metaboliti secundarii. Inoltre, un altru studiu hà dimustratu chì a riduzione di l'ombreggiatura aumenta l'esposizione à u sole, aumentendu cusì e temperature diurne in l'habitat naturale di *Hypericum perforatum*, chì cuntribuisce ancu à un aumentu di u rendimentu di l'ipericina. Basatu annantu à questi dati, questu studiu hà investigatu u rolu di e nanoparticelle di ferru cum'è potenziali induttori in a cultura tissutale. I risultati anu dimustratu chì queste nanoparticelle ponu attivà i geni implicati in a biosintesi di l'esperidina per mezu di a stimulazione enzimatica, purtendu à una maggiore accumulazione di questu cumpostu (Fig. 2). Dunque, paragunatu à e piante chì crescenu in cundizioni naturali, si pò sustene chì a pruduzzione di tali cumposti in vivo pò ancu esse migliorata quandu u stress moderatu hè cumminatu cù l'attivazione di geni implicati in a biosintesi di metaboliti secundarii. I trattamenti di cumminazione anu generalmente un effettu pusitivu nantu à u tassu di rigenerazione, ma in certi casi, questu effettu hè indebulitu. In particulare, u trattamentu cù 1 mg/L di 2,4-D, 1,5 mg/L di chinasi, è diverse concentrazioni puderia aumentà indipindentamente è significativamente u tassu di rigenerazione di 50,85% paragunatu à u gruppu di cuntrollu (Fig. 4c). Quessi risultati suggerenu chì cumminazzioni specifiche di nanohormoni ponu agisce in modu sinergicu per prumove a crescita di e piante è a pruduzzione di metaboliti, ciò chì hè di grande impurtanza per a cultura tissutale di e piante medicinali. Palmer è Keller [50] anu dimustratu chì u trattamentu cù 2,4-D puderia induce indipindentamente a furmazione di callu in St. perforatum, mentre chì l'aghjunta di chinasi hà aumentatu significativamente a furmazione è a rigenerazione di callu. Questu effettu era duvutu à u miglioramentu di l'equilibriu ormonale è a stimulazione di a divisione cellulare. Bal et al. [51] anu trovu chì u trattamentu cù Fe₃O₄-NP puderia migliurà indipindentamente a funzione di l'enzimi antioxidanti, prumovendu cusì a crescita di e radiche in St. perforatum. I terreni di cultura chì cuntenenu nanoparticelle di Fe₃O₄ à concentrazioni di 0,5 mg/L, 1 mg/L è 1,5 mg/L anu migliuratu u tassu di rigenerazione di e piante di linu [52]. L'usu di chinetina, 2,4-diclorobenzotiazolinone, è nanoparticelle di Fe₃O₄ hà migliuratu significativamente i tassi di furmazione di calli è radiche, ma i putenziali effetti secundarii di l'usu di sti ormoni per a rigenerazione in vitro devenu esse cunsiderati. Per esempiu, l'usu à longu andà o à alta concentrazione di 2,4-diclorobenzotiazolinone o chinetina pò purtà à variazione clonale somatica, stress ossidativu, morfologia anormale di u callu, o vitrificazione. Dunque, un altu tassu di rigenerazione ùn predice micca necessariamente a stabilità genetica. Tutte e piante rigenerate devenu esse valutate aduprendu marcatori moleculari (per esempiu RAPD, ISSR, AFLP) o analisi citogenetica per determinà a so omogeneità è similitudine cù e piante in vivo [53,54,55].
Stu studiu hà dimustratu per a prima volta chì l'usu cumminatu di regulatori di crescita di e piante (2,4-D è chinetina) cù nanoparticule di Fe₃O₄ pò migliurà a morfogenesi è l'accumulazione di metaboliti bioattivi chjave (cumpresi l'ipericina è l'iperoside) in *Hypericum perforatum*. U regime di trattamentu ottimizatu (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L chinetina + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) ùn hà micca solu massimizatu a furmazione di calli, l'organogenesi è u rendimentu di metaboliti secundarii, ma hà ancu dimustratu un effettu induttivu lieve, potenzialmente migliurendu a tolleranza à u stress è u valore medicinale di a pianta. A cumbinazione di nanotecnologia è cultura di tessuti vegetali furnisce una piattaforma sustenibile è efficiente per a pruduzzione in vitro à grande scala di cumposti medicinali. Quessi risultati aprenu a strada à applicazioni industriali è ricerche future nantu à i meccanismi moleculari, l'ottimisazione di u dosaggio è a precisione genetica, culligendu cusì a ricerca fundamentale nantu à e piante medicinali cù a biotecnologia pratica.
Data di publicazione: 12 dicembre 2025