A crescita di u meristemu apicale (SAM) hè criticu per l'architettura di u troncu. Ormoni vegetaligibberellini(GA) ghjucanu un rolu chjave in a coordinazione di a crescita di e piante, ma u so rolu in a SAM resta pocu capitu. Quì, avemu sviluppatu un biosensore ratiometricu di signalazione GA ingegneriale a proteina DELLA per soppressà a so funzione regulatoria essenziale in a risposta trascrizionale GA, preservando a so degradazione dopu a ricunniscenza GA. Dimustremu chì stu biosensore basatu à a degradazione registra accuratamente i cambiamenti in i livelli di GA è a sensazione cellulare durante u sviluppu. Avemu usatu stu biosensore per cartografia l'attività di signalazione GA in u SAM. Nous montrons que les signaux GA élevés sont présents principalement dans les cellules situées entre les primordies d'organes, qui sont des précurseurs des cellules internes. Utilizendu approcci di guadagnà è di perdita di funzione, dimustramu ancu chì GA regula l'orientazione di u pianu di a divisione cellulare, stabilendu l'urganizazione cellulare canonica di l'internodi, prumove cusì a specificazione di l'internode in u SAM.
U shoot apical meristem (SAM), situatu à l'apex di u shooter, cuntene un nichulu di cellule staminali chì l'attività genera organi laterali è nodi staminali in modu modulare è iterativu in tutta a vita di a pianta. Ciascuna di queste unità ripetitive, o nodi di a pianta, include internodi è organi laterali à i nodi, è meristemi axillary in l'axila foglia1. A crescita è l'urganizazione di i nodi di a pianta cambia durante u sviluppu. In Arabidopsis, a crescita internodale hè suppressa durante a fase vegetativa, è i meristemi axillary restanu dorme in l'axili di e foglie rosette. Duranti a transizione à a fase fiurali, u SAM diventa u meristemu di inflorescenza, generendu internodi allungati è boccioli axillary, branchlets in l'axils di foglie cauline, è più tardi, fiori senza foglie2. Ancu s'è avemu fattu un prugressu significativu in l'intelligenza di i miccanismi chì cuntrolanu l'iniziu di foglie, fiori è rami, hè pocu pocu cunnisciutu cumu si nascenu l'internodi.
A capiscitura di a distribuzione spazio-temporale di GAs aiuterà à capisce megliu e funzioni di sti hormone in diversi tessuti è in diverse tappe di sviluppu. A visualizazione di a degradazione di a fusione RGA-GFP espressa sottu l'azzione di u so propiu promotore furnisce infurmazioni impurtanti nantu à a regulazione di i livelli totali di GA in i radichi15,16. Tuttavia, l'espressione RGA varieghja trà tissuti17 è hè regulata da GA18. Cusì, l'espressione differenziale di u promotore RGA pò risultà in u mudellu di fluorescenza osservatu cù RGA-GFP è cusì stu metudu ùn hè micca quantitative. Più recentemente, GA19,20 marcatu cù fluoresceina bioattiva (Fl) hà revelatu l'accumulazione di GA in l'endocortex radicali è a regulazione di i so livelli cellulari da u trasportu di GA. Recentemente, u sensoru GA FRET nlsGPS1 hà dimustratu chì i livelli di GA sò correlati cù l'allungamentu di e cellule in radiche, filamenti è ipocotili scuri21. Tuttavia, cum'è avemu vistu, a cuncentrazione di GA ùn hè micca l'unicu paràmetru chì cuntrolla l'attività di signalazione GA, postu chì dipende di prucessi di sensazione cumplessi. Quì, basandu nantu à a nostra cunniscenza di i camini di signalazione DELLA è GA, rappurtamu u sviluppu è a carattarizazione di un biosensore ratiometricu basatu in degradazione per a signalazione GA. Per sviluppà stu biosensore quantitativo, avemu usatu un RGA mutante GA-sensibile chì hè stata fusa à una proteina fluorescente è ubiquitously espressa in tissuti, è ancu una proteina fluorescente insensibile à GA. Dimustremu chì e fusioni di proteina RGA mutante ùn interferiscenu micca cù a signalazione GA endogena quandu ubiquitously espressa, è chì stu biosensore pò quantificà l'attività di signalazione risultante sia da l'input GA sia da l'elaborazione di u signale GA da l'apparatu di sensazione cù alta risoluzione spazio-temporale. Avemu usatu stu biosensore per cartografia a distribuzione spazio-temporale di l'attività di signalazione GA è quantificà cumu GA regula u cumpurtamentu cellulare in l'epidermisa SAM. Dimustremu chì GA regula l'orientazione di u pianu di divisione di e cellule SAM situate trà primordi di l'organu, definendu cusì l'urganizazione cellulare canonica di l'internode.
Infine, avemu dumandatu se qmRGA puderia signalà cambiamenti in i livelli endogeni di GA cù ipocotili in crescita. Avemu dimustratu prima chì u nitrate stimula a crescita aumentandu a sintesi di GA è, à u turnu, a degradazione di DELLA34. In cunsiquenza, avemu osservatu chì a lunghezza di l'ipocotile in pUBQ10:: qmRGA piantini cultivati sottu un fornimentu abbundante di nitrati (10 mM NO3-) era significativamente più longu di quellu in e piantini cultivati in cundizioni di carenza di nitrati (Figura supplementaria 6a). In cunfurmità cù a risposta di crescita, i signali GA eranu più alti in ipocotili di piantini cultivati in cundizioni 10 mM NO3- chì in e piantini cultivati in l'absenza di nitrati (Figura supplementaria 6b, c). Cusì, qmRGA permette ancu u monitoraghju di i cambiamenti in a signalazione GA indotta da cambiamenti endogeni in a cuncentrazione di GA.
Per capiscenu se l'attività di signalazione GA rilevata da qmRGA dipende da a cuncentrazione GA è a percezione GA, cum'è l'aspittava nantu à u disignu di u sensoru, avemu analizatu l'espressione di i trè receptori GID1 in i tessuti vegetativi è riproduttivi. In e piantini, a linea di reporter GID1-GUS hà dimustratu chì GID1a è c sò stati assai spressi in cotyledons (Fig. 3a-c). Inoltre, tutti i trè receptori sò stati spressi in foglie, primordia di a radica laterale, punte di e radiche (eccettu per u capu di a radica di GID1b), è u sistema vascular (Fig. 3a-c). In l'inflorescenza SAM, avemu detectatu signali GUS solu per GID1b è 1c (Figura Supplementaria 7a-c). L'ibridazione in situ hà cunfirmatu questi mudelli di espressione è hà ancu dimustratu chì GID1c hè stata espressa uniformemente à bassi livelli in u SAM, mentri GID1b hà mostratu espressione più altu à a periferia di u SAM (Figura supplementaria 7d-l). A fusione di traduzzione pGID1b::2xmTQ2-GID1b hà ancu revelatu una gamma graduata di espressione GID1b, da espressione bassa o nulla in u centru di u SAM à espressione alta à i cunfini di l'urgani (Figura supplementaria 7m). Cusì, i receptori GID1 ùn sò micca distribuiti uniformemente à traversu è in i tessuti. In esperimenti sussegwenti, avemu ancu osservatu chì l'overexpression di GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) hà aumentatu a sensibilità di qmRGA in ipocotili à l'applicazione esterna di GA (Fig. 3d, e). In cuntrastu, a fluoriscenza misurata da qd17mRGA in l'ipocotile era insensibile à u trattamentu GA3 (Fig. 3f, g). Per i dui saggi, e piantini sò stati trattati cun alta concentrazione di GA (100 μM GA3) per valutà u cumpurtamentu rapidu di u sensoru, induve a capacità di ligà à u receptore GID1 hè stata rinfurzata o persa. Inseme, sti risultati cunfirmanu chì u biosensore qmRGA serve una funzione cumminata cum'è un sensor GA è GA, è suggerenu chì l'espressione differenziale di u receptore GID1 pò modulà significativamente l'emissività di u sensore.
A data, a distribuzione di signali GA in u SAM ùn hè micca chjaru. Per quessa, avemu usatu e piante chì esprimenu qmRGA è u reporter di cellule staminali pCLV3::mCherry-NLS35 per calculà carte quantitative d'alta risoluzione di l'attività di signalazione di GA, cuncintratu nantu à a strata L1 (epidermis; Fig. 4a, b, vedi Methods and Supplementary Methods), postu chì L1 hè un rolu chjave in u cuntrollu di a crescita SAM. Quì, l'espressione pCLV3::mCherry-NLS hà furnitu un puntu di riferimentu geomètrico fissu per analizà a distribuzione spazio-temporale di l'attività di signalazione GA37. Ancu s'ellu GA hè cunsideratu essenziale per u sviluppu di l'urgani laterali4, avemu osservatu chì i signali GA eranu bassu in u primurdium fiurali (P) à partesi da u stadiu P3 (Fig. 4a, b), mentri i ghjovani P1 è P2 primordi avianu una attività moderata simili à quella in a regione cintrali (Fig. 4a, b). L'attività di signalazione GA più alta hè stata rilevata à i cunfini di l'organu primordi, cuminciendu à P1 / P2 (à i lati di u cunfini) è culminendu à P4, è ancu in tutte e cellule di a regione perifèrica situata trà i primordi (Fig. 4a, b è Supplementary Fig. 8a, b). Questa attività di signalazione GA più alta hè stata osservata micca solu in l'epidermisa, ma ancu in i strati L2 è L3 superiore (Figura Supplementaria 8b). U mudellu di i signali GA rilevati in u SAM cù qmRGA hè statu ancu invariatu cù u tempu (Figura supplementaria 8c-f, k). Ancu se a custruzzione qd17mRGA hè stata sistematicamente downregulated in u SAM di e piante T3 da cinque linee indipendenti chì avemu carattarizatu in dettagliu, pudemu analizà i mudelli di fluorescenza ottenuti cù u pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP custruita (Figura Supplementaria 8g-j, l). In questa linea di cuntrollu, solu cambiamenti minori in u rapportu di fluoriscenza sò stati rilevati in u SAM, ma in u centru SAM avemu osservatu una diminuzione chjara è inaspettata in VENUS assuciata à TagBFP. Questu cunferma chì u mudellu di signalazione osservatu da qmRGA riflette a degradazione dipendente da GA di mRGA-VENUS, ma ancu dimostra chì qmRGA pò sopravvalutà l'attività di signalazione GA in u centru di meristem. En résumé, nos résultats révèlent un modèle de signalisation GA qui reflète principalement la distribution des primordies. Questa distribuzione di a regione inter-primordiali (IPR) hè duvuta à u stabilimentu graduali di l'attività di signalazione GA elevata trà u primurziu di sviluppu è a regione cintrali, mentri à u stessu tempu l'attività di signalazione GA in u primurdiu diminuite (Fig. 4c, d).
A distribuzione di i receptori GID1b è GID1c (vede sopra) suggerisce chì l'espressione differenziale di i receptori GA aiuta à furmà u mudellu di l'attività di signalazione GA in u SAM. Avemu dumandatu se l'accumulazione differenziale di GA puderia esse implicata. Per investigà sta pussibilità, avemu usatu u nlsGPS1 GA FRET sensor21. A frequenza di attivazione aumentata hè stata rilevata in u SAM di nlsGPS1 trattatu cù 10 μM GA4 + 7 per 100 min (Figura Supplementaria 9a-e), chì indica chì nlsGPS1 risponde à i cambiamenti in a concentrazione di GA in u SAM, cum'è in roots21. A distribuzione spaziale di a freccia di attivazione nlsGPS1 hà revelatu livelli di GA relativamente bassu in i strati esterni di u SAM, ma hà dimustratu chì eranu elevati in u centru è à i cunfini di u SAM (Fig. 4e è Supplementary Fig. 9a, c). Questu suggerisce chì GA hè ancu distribuitu in u SAM cù un mudellu spaziale paragunabile à quellu revelatu da qmRGA. Cum'è un approcciu cumplementariu, avemu ancu trattatu u SAM cù GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl solu cum'è un cuntrollu negativu. U signalu Fl hè statu distribuitu in tuttu u SAM, cumpresa a regione cintrali è u primurdium, anche à una intensità più bassa (Fig. 4j è Supplementary Fig. 10d). In cuntrastu, tutti i trè GA-Fl s'acumulanu specificamente in i frontiere di primurdium è à varii gradi in u restu di l'IPR, cù GA7-Fl accumulendu in u duminiu più grande in l'IPR (Fig. 4k è Supplementary Fig. 10a, b). A quantificazione di l'intensità di fluorescenza hà revelatu chì u rapportu di intensità IPR à non-IPR era più altu in SAM trattatu GA-Fl cumparatu cù SAM trattatu Fl (Fig. 4l è Supplementary Fig. 10c). Inseme, sti risultati suggerenu chì GA hè presente à cuncentrazione più altu in i celluli IPR chì si trovanu più vicinu à a fruntiera di l'organu. Questu suggerisce chì u mudellu di l'attività di signalazione di SAM GA risulta sia da l'espressione differenziale di i receptori GA sia da l'accumulazione differenziale di GA in cellule IPR vicinu à e fruntiere di l'organi. Cusì, a nostra analisi hà revelatu un mudellu spatiotemporale inespettatu di signalazione GA, cù attività più bassa in u centru è primurdium di u SAM è attività più altu in l'IPR in a regione periferica.
Per capisce u rolu di l'attività di segnalazione GA differenziale in u SAM, avemu analizatu a correlazione trà l'attività di segnalazione GA, l'espansione cellulare è a divisione cellulare utilizendu l'imaghjini in time-lapse in tempu reale di u SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Data u rolu di GA in a regulazione di a crescita, era prevista una correlazione positiva cù i paràmetri di espansione di e cellule. Dunque, avemu prima paragunatu e carte di l'attività di segnalazione GA cù carte di a crescita di a superficia cellulare (cum'è un proxy per a forza di l'espansione cellulare per una cellula data è per e cellule figliole in divisione) è cù carte di anisotropia di crescita, chì misuranu a direzzione di l'espansione cellulare (aduprata ancu quì per una cellula data è per e cellule figliole in divisione; Fig. 5a, b, vede Methods). I nostri mapi di a crescita di a superficia di a cellula SAM sò cunsistenti cù l'osservazioni previ38,39, cù i ritmi di crescita minima à u cunfini è i ritmi di crescita massimi in i fiori di sviluppu (Fig. 5a). L'analisi di cumpunenti principali (PCA) hà dimustratu chì l'attività di signalazione GA era correlata negativamente cù l'intensità di crescita di a superficia cellulare (Figura 5c). Avemu ancu dimustratu chì l'assi principali di variazione, cumprese l'input di signalazione GA è l'intensità di crescita, eranu ortogonali à a direzzione determinata da l'espressione CLV3 alta, cunfirmendu l'esclusione di e cellule da u centru SAM in l'analisi restante. L'analisi di correlazione di Spearman hà cunfirmatu i risultati PCA (Figura 5d), chì indicanu chì i segnali GA più elevati in l'IPR ùn anu micca risultatu in una espansione cellulare più alta. Tuttavia, l'analisi di correlazione hà revelatu una ligera correlazione positiva trà l'attività di signalazione GA è l'anisotropia di crescita (Figura 5c, d), suggerenu chì a signalazione GA più alta in l'IPR influenza a direzzione di a crescita cellulare è possibbilmente a pusizione di u pianu di divisione cellulare.
a, b Carte di calore di a crescita media di a superficia (a) è di l'anisotropia di crescita (b) in SAM in media di sette piante indipendenti (usate cum'è proxy per a forza è a direzzione di l'espansione cellulare, rispettivamente). c L'analisi PCA includenu e seguenti variabili: GA signal, intensità di crescita di a superficia, anisotropia di crescita di a superficia è espressione CLV3. U cumpunente PCA 1 era principalmente correlatu negativamente cù l'intensità di crescita di a superficia è correlati positivamente cù u signale GA. A cumpunente PCA 2 hè stata principalmente correlata positivamente cù l'anisotropia di crescita di a superficia è correlata negativamente cù l'espressione CLV3. I percentuale rapprisentanu a variazione spiegata da ogni cumpunente. d Analisi di a correlazione di Spearman trà u signale GA, l'intensità di a crescita di a superficia è l'anisotropia di a crescita di a superficia à a scala di tissuti escludendu CZ. U numeru à a diritta hè u valore Spearman rho trà dui variàbili. L'asterischi indicanu casi induve a correlazione / correlazione negativa hè assai significativa. e Visualizzazione 3D di cellule Col-0 SAM L1 per microscopia confocale. I muri di e cellule novi furmati in u SAM (ma micca u primordium) à 10 h sò culurati secondu i so valori d'angolo. A barra di culore hè mostrata in u cantonu in basso à destra. L'inseritu mostra l'imaghjini 3D currispundenti à 0 h. L'esperimentu hè stata ripetuta duie volte cù risultati simili. f I box plots mostranu i tassi di divisione cellulare in IPR è non-IPR Col-0 SAM (n = 10 piante indipendenti). A linea centrale mostra a mediana, è i cunfini di scatula indicanu i percentili 25 è 75. Whiskers indicanu i valori minimi è massimi determinati cù u software R. I valori di P sò stati ottenuti cù u test t à duie code di Welch. g, h Diagramma schematicu chì mostra (g) cumu si misurà l'angolo di u novu muru cellulare (magenta) in quantu à a direzzione radiale da u centru di u SAM (linea punteggiata bianca) (solu i valori di l'angulu agutu, ie, 0-90 °, sò cunsiderati), è (h) a direzzione circunferenziale / laterale è radiale in u meristemu. i Histogrammi di frequenza di l'orientazione di u pianu di a divisione cellulare in SAM (blu scuru), IPR (blu mediu) è non-IPR (blu chjaru), rispettivamente. I valori P sò stati ottenuti da una prova di Kolmogorov-Smirnov à dui coda. L'esperimentu hè stata ripetuta duie volte cù risultati simili. j Istogrammi di frequenza di l'orientazione di u pianu di divisione cellulare di l'IPR intornu à P3 (verde chiaru), P4 (verde mediu) è P5 (verde scuru), rispettivamente. I valori P sò stati ottenuti da una prova di Kolmogorov-Smirnov à dui coda. L'esperimentu hè stata ripetuta duie volte cù risultati simili.
Per quessa, avemu investigatu dopu a correlazione trà a signalazione di GA è l'attività di a divisione cellulare identificendu pareti di cellula nova formate durante l'assay (Fig. 5e). Stu approcciu ci hà permessu di misurà a freccia è a direzzione di a divisione cellulare. Sorprendentemente, avemu truvatu chì a freccia di e divisioni di cellula in l'IPR è u restu di u SAM (non-IPR, Fig. 5f) era simili, chì indicanu chì e differenze in a signalazione GA trà e cellule IPR è non-IPR ùn anu micca significativamente a divisione cellulare. Questu, è a correlazione positiva trà a signalazione GA è l'anisotropia di crescita, ci hà incitatu à cunsiderà se l'attività di signalazione GA puderia influene l'orientazione di u pianu di a divisione cellulare. Avemu misuratu l'orientazione di u novu muru di cellula cum'è un angolo agutu relative à l'assi radiale chì cunnetta u centru di meristemu è u centru di u novu muru di cellula (Fig. 5e-i) è hà osservatu una tendenza chjara per e cellule à dividisce in anguli vicinu à 90 ° relative à l'assi radiale, cù e frequenze più alte osservate à 70-80-28 %) (83.20 . (Fig. 5e, i), chì currisponde à e divisioni cellulari in a direzzione circunferencial / transversale (Fig. 5h). Per esaminà a cuntribuzione di a signalazione GA à stu cumpurtamentu di a divisione cellulare, avemu analizatu i paràmetri di a divisione cellulare in l'IPR è non-IPR separatamente (Fig. 5i). Avemu osservatu chì a distribuzione di l'angolo di divisione in e cellule IPR differisce da quella in cellule non-IPR o in cellule in tutta a SAM, cù e cellule IPR chì mostranu una proporzione più alta di divisioni di cellule laterali / circulari, vale à dì, 70-80 ° è 80-90 ° (33.86% è 30.71%, rispettivamente, proporzioni currispondenti) (Fig. 5i). Cusì, i nostri osservazioni anu revelatu una associazione trà l'alta signalazione di GA è l'orientazione di u pianu di a divisione cellula vicinu à a direzzione circunferencial, simili à a correlazione trà l'attività di signalazione GA è l'anisotropia di crescita (Fig. 5c, d). Per stabilisce più a cunservazione spaziale di sta associazione, avemu misuratu l'orientazione di u pianu di divisioni in i celi IPR chì circundanu u primurdium partendu da P3, postu chì a più alta attività di signalazione GA hè stata rilevata in questa regione partendu da P4 (Fig. 4). L'anguli di divisioni di l'IPR intornu à P3 è P4 ùn anu micca differenzi statisticamente significativu, ancu s'è una freccia aumentata di divisioni di e cellule laterali hè stata osservata in l'IPR intornu à P4 (Fig. 5j). In ogni casu, in i celluli IPR intornu à P5, a diffarenza in l'orientazione di u pianu di a divisione cellula hè stata statisticamente significativa, cun un forte aumentu di a freccia di e divisioni transverse cell (Fig. 5j). Inseme, sti risultati suggerenu chì a signalazione GA pò cuntrullà l'orientazione di e divisioni cellulari in u SAM, chì hè coherente cù i rapporti precedenti40,41 chì a signalazione alta GA pò induce l'orientazione laterale di e divisioni celulari in l'IPR.
Hè previstu chì e cellule in l'IPR ùn saranu micca incorporati in primordi, ma piuttostu in internodes2,42,43. L'orientazione trasversale di e divisioni di e cellule in l'IPR pò esse risultatu in l'urganizazione tipica di fila longitudinali paralleli di e cellule epidermiche in internodes. I nostri osservazioni descritti sopra suggerenu chì a signalazione GA prubabilmente ghjucà un rolu in stu prucessu regulendu a direzzione di a divisione cellulare.
Loss of function di parechji genes DELLA risultati in una risposta GA custitutivu, è della mutanti pò ièssiri usatu pi pruvà sta hypothesis44. Avemu prima analizatu i mudelli di espressione di cinque genes DELLA in u SAM. A fusione transcriptionale di a linea GUS45 hà revelatu chì GAI, RGA, RGL1 è RGL2 (in una misura assai menu) sò stati spressi in u SAM (Figura Supplementaria 11a-d). L'ibridazione in situ hà ancu dimustratu chì l'ARNm GAI s'accumula specificamente in primordi è fiori in sviluppu (Figura supplementaria 11e). L'ARNm RGL1 è RGL3 sò stati rilevati in tuttu u canopy SAM è in i fiori più vechji, mentri l'ARNm RGL2 era più abbundante in a regione di u cunfini (Figura supplementaria 11f-h). L'imaghjini cunfocali di pRGL3::RGL3-GFP SAM cunfirmò l'espressione osservata da l'ibridazione in situ è hà dimustratu chì a proteina RGL3 s'accumula in a parti cintrali di u SAM (Figura supplementaria 11i). Utilizendu a linea pRGA::GFP-RGA, avemu ancu truvatu chì a proteina RGA s'accumula in u SAM, ma a so abbundanza diminuite à u cunfini partendu da P4 (Figura supplementaria 11j). In particulare, i mudelli di spressione di RGL3 è RGA sò cunsistenti cù l'attività di signalazione GA più alta in l'IPR, cum'è detecatu da qmRGA (Fig. 4). Inoltre, sti dati indicanu chì tutti i DELLA sò spressi in u SAM è chì a so spressione cullettivu stende in tuttu u SAM.
Avemu dopu analizatu i paràmetri di a divisione cellulare in u SAM salvaticu (Ler, cuntrollu) è u gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Fig. 6a, b). Curiosamente, avemu osservatu un cambiamentu statisticamente significativu in a distribuzione di frequenze di l'angulu di divisione cellula in u SAM mutant della global in paragunà à u tipu salvaticu (Fig. 6c). Stu cambiamentu in u della mutante glubale era duvuta à un incrementu in a freccia di 80-90 ° angles (34.71% vs 24.55%) è, à una misura menu, 70-80 ° angles (23.78% vs. 20.18%), ie, currispundenu à divisioni cellula transverse (Fig. 6c). A freccia di divisioni non-transverse (0-60 °) era ancu più bassu in u della mutante glubale (Fig. 6c). A freccia di e divisioni di cellula trasversali hè stata significativamente aumentata in u SAM di u mutante globale della (Fig. 6b). A freccia di divisioni cellula trasversali in l 'IPR era ancu più altu in u mutante della glubale cumparatu à u tipu salvaticu (Fig. 6d). Fora di u rughjonu IPR, u tipu salvaticu avia una distribuzione più uniforme di anguli di divisioni cellula, mentri lu mutanti della global prifirutu divisioni tangentiali cum'è l 'IPR (Fig. 6e). Avemu ancu quantificatu l'orientazione di e divisioni cellulare in u SAM di ga2 oxidase (ga2ox) mutanti quintuple (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, è ga2ox6-2), un fondo mutante inattivu GA in quale GA accumula. In cunfurmità cù l'aumentu di i livelli di GA, a SAM di l'inflorescenza mutante quintupla ga2ox era più grande di quella di Col-0 (Figura supplementaria 12a, b), è paragunata à Col-0, u quintuple ga2ox SAM mostrava una distribuzione distinta di l'anguli di divisione cellulare, cù a frequenza di l'angolo chì aumentava da 50 °, à a divisione supplementaria di novu favurendu (90 °, divisioni supplementarii). Fig. 12a-c). Cusì, mostramu chì l'attivazione costitutiva di a signalazione GA è l'accumulazione di GA induce divisioni di e cellule laterali in l'IPR è u restu di u SAM.
a, b Visualizazione 3D di a strata L1 di Ler (a) è di u mutante globale (b) SAM cù a microscopia cunfocale. I muri di e cellule novi formati in u SAM (ma micca u primordium) nantu à un periodu di 10 h sò mostrati è culurati secondu i so valori di l'angulu. L'inseritu mostra u SAM à 0 h. A barra di culore hè visualizata in u cantonu in basso à destra. La flèche dans (b) pointe vers un exemple de fichiers cellulaires alignés dans le mutant globale della. L'esperimentu hè stata ripetuta duie volte cù risultati simili. ce comparaison de la répartition des fréquences des orientations du plan de division cellulaire dans l'ensemble SAM (d), IPR (e) et non IPR (f) entre Ler et globale della. I valori P sò stati ottenuti utilizendu una prova di Kolmogorov-Smirnov à duie code. f, g Visualizzazione 3D di immagini confocali di piante transgeniche SAM colorate con PI di Col-0 (i) e pCUC2::gai-1-VENUS (j). I pannelli (a, b) mostranu novi pareti cellulari (ma micca primordi) furmati in u SAM in 10 h. L'esperimentu hè stata ripetuta duie volte cù risultati simili. h–j Comparazione di a distribuzione di freccia di l'orientazione di u pianu di a divisione cellulare situata in tutta a SAM (h), IPR (i) è non-IPR (j) trà Col-0 è pCUC2::gai-1-VENUS piante. I valori P sò stati ottenuti utilizendu una prova di Kolmogorov-Smirnov à duie code.
Dopu avemu pruvatu l'effettu di inibisce a signalazione GA specificamente in l'IPR. Per questu scopu, avemu usatu u promotore di cotyledon cup 2 (CUC2) per guidà l'espressione di una proteina gai-1 negativa dominante fusa à VENUS (in a linea pCUC2::gai-1-VENUS). In u SAM di tipu salvaticu, u promotore CUC2 guida l'espressione di a maiò parte di l'IPR in u SAM, cumprese e cellule di fruntiera, da P4 in avanti, è l'espressione specifica simile hè stata osservata in i pianti pCUC2::gai-1-VENUS (vede sottu). A distribuzione di l'anguli di a divisione cellula in u SAM o IPR di e piante pCUC2::gai-1-VENUS ùn era micca significativamente sfarente di quellu di u tipu salvaticu, ancu s'è inespettatu avemu trovu chì e cellule senza un IPR in questi pianti divisu à una freccia più altu di 80-90 ° (Fig. 6f-j).
Hè statu suggeritu chì a direzzione di a divisione cellulare dipende da a geometria di u SAM, in particulare u stress tensile generatu da a curvatura di u tissutu46. Avemu dunque dumandatu s'ellu a forma di u SAM hè stata alterata in u mutante globale è pCUC2::gai-1-VENUS piante. Cum'è infurmatu prima12, a dimensione di u SAM mutante globale della era più grande di quella di u tipu salvaticu (Figura supplementaria 13a, b, d). L'hibridazione in situ di CLV3 è STM RNA cunfirmò l'espansione di meristema in della mutanti è dimustrava in più l'espansione laterale di u niche di e cellule staminali (Figura supplementaria 13e, f, h, i). In ogni casu, a curvatura SAM era simile in i dui genotipi (Figura Supplementaria 13k, m, n, p). Avemu osservatu un incrementu simili in a dimensione in u gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant senza un cambiamentu di curvatura cumparatu cù u tipu salvaticu (Figura supplementaria 13c, d, g, j, l, o, p). A freccia di l'orientazione di a divisione cellula hè stata ancu affettata in u mutante quadruple della della, ma in una misura menu chì in u mutante monoliticu della (Figura supplementaria 12d-f). Stu effettu dosage, nsemi a mancanza di un effettu nant'à curvature, suggerisce chì l'attività RGL3 residuale in u quadruple mutante Della limita i cambiamenti in l'orientazione di a divisione cellula causata da a perdita di l'attività DELLA è chì i cambiamenti in e divisioni di e cellule laterali si trovanu in risposta à i cambiamenti in l'attività signaling GA invece di i cambiamenti in a geometria SAM. Cum'è descrittu sopra, u promotore CUC2 conduce l'espressione IPR in u SAM partendu da P4 (Figura Supplementaria 14a, b), è in cuntrastu, u pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM avia una dimensione ridutta ma curvatura più alta (Figura Supplementaria 14c-h). Stu cambiamentu in a morfologia pCUC2::gai-1-VENUS SAM pò esse risultatu in una distribuzione sfarente di stresses meccanichi paragunatu à u tipu salvaticu, in quale l'alti stressi circunferenciali cumincianu à una distanza più corta da u centru SAM47. In alternativa, i cambiamenti in a morfologia pCUC2::gai-1-VENUS SAM pò esse risultatu da cambiamenti in e proprietà meccaniche regiunale indotte da l'espressione transgene48. In i dui casi, questu puderia cumpensà parzialmente l'effetti di i cambiamenti in a signalazione GA aumentendu a probabilità chì e cellule si dividenu in l'orientazione circunferenziale / trasversale, spieghendu e nostre osservazioni.
Inseme, i nostri dati cunfirmanu chì a signalazione GA più alta ghjoca un rolu attivu in l'orientazione laterale di u pianu di divisione cellulare in l'IPR. Mostranu ancu chì a curvatura di meristema influenza ancu l'orientazione di u pianu di divisione cellulare in l'IPR.
L'orientazione trasversale di u pianu di divisione in l'IPR, per via di l'alta attività di signalizazione GA, suggerisce chì GA pre-organiza un schedariu di cellula radiale in l'epidermisa in u SAM per definisce l'urganizazione cellulare chì si trova dopu in l'internode epidermale. Infatti, tali schedari cellula eranu friquintimenti visibili in images SAM di della mutanti glubale (Fig. 6b). Cusì, per spiegà più a funzione di u sviluppu di u mudellu spaziale di a signalazione GA in u SAM, avemu usatu l'imaghjini di time-lapse per analizà l'urganizazione spaziale di e cellule in l'IPR in wild-type (Ler and Col-0), della mutanti global, è pCUC2::gai-1-VENUS transgenic plants.
Avemu trovu chì qmRGA hà dimustratu chì l'attività di signalazione di GA in l'IPR hà aumentatu da P1 / P2 è hà culminatu à P4, è questu patronu restava constantu à u tempu (Fig. 4a-f è Supplementary Fig. 8c-f, k). Per analizà l'urganizazione spaziale di e cellule in l'IPR cù u segnu GA crescente, avemu marcatu e cellule Ler IPR sopra è à i lati di P4 secondu u so destinu di sviluppu analizatu 34 h dopu a prima osservazione, vale à dì, più di duie volte plastidi, chì ci permettenu di seguità e cellule IPR durante u sviluppu di primurdium da P1 / P2 à P4. Avemu usatu trè culori diffirenti: u giallu per quelli chì sò stati integrati in u primurdium vicinu à P4, verdi per quelli chì eranu in l'IPR, è viole per quelli chì participanu à i dui prucessi (Fig. 7a-c). À t0 (0 h), 1-2 strati di cellula IPR eranu visibili davanti à P4 (Fig. 7a). Cum'è l'espertu, quandu sti celluli divisu, anu fattu principarmenti per via di u pianu di divisione transversale (Figs. 7a-c). I risultati simili sò stati ottenuti cù Col-0 SAM (focusing on P3, chì u cunfini plegamenti simili à P4 in Ler), ancu s'ellu in questu genotipu, u pliu furmatu à u cunfini fiurali hà oculatu e cellule IPR più rapidamente (Fig. 7g-i). Cusì, u mudellu di divisione di e cellule IPR pre-urganizà e cellule in fila radiali, cum'è in internodes. L'urganizazione di e fila radiali è a localizazione di e cellule IPR trà l'organi successivi suggerenu chì queste cellule sò progenitori internodali.
Quì, avemu sviluppatu un biosensore di segnalazione GA ratiometric, qmRGA, chì permette una mappatura quantitativa di l'attività di segnalazione GA risultante da concentrazioni di receptore GA è GA cumminate mentre minimizeghja l'interferenza cù i percorsi di segnalazione endogeni, fornendu cusì infurmazione nantu à a funzione GA à u livellu cellulare. À questu scopu, avemu custruitu una proteina DELLA mudificata, mRGA, chì hà persu a capacità di unisce i partenarii di l'interazzione DELLA, ma resta sensibile à a proteolisi indotta da GA. qmRGA risponde à i cambiamenti esogeni è endogeni in i livelli di GA, è e so proprietà di sensazione dinamica permettenu a valutazione di i cambiamenti spazio-temporali in l'attività di signalazione GA durante u sviluppu. qmRGA hè ancu un strumentu assai flexible chì pò esse adattatu à diversi tessuti cambiendu u promotore utilizatu per a so espressione (se necessariu), è datu a natura cunservata di a via di signalazione GA è u mutivu PFYRE à traversu angiosperms, hè prubabile di esse trasferibile à altre spezie22. In cunfurmità cù questu, una mutazione equivalente in a proteina di risu SLR1 DELLA (HYY497AAA) hè statu ancu dimustrata per suppressione l'attività repressora di crescita di SLR1 mentre chì solu ligeramente riduce a so degradazione mediata da GA, simile à mRGA23. In particulare, studii recenti in Arabidopsis anu dimustratu chì una sola mutazione di aminoacidu in u duminiu PFYRE (S474L) hà alteratu l'attività trascrizionale di RGA senza affettà a so capacità d'interagisce cù i partenarii di fattore di trascrizione50. Ancu s'è sta mutazione hè assai vicinu à i sustituzzioni di 3 aminoacidi prisenti in mRGA, i nostri studii mostranu chì sti dui mutazioni alteranu e caratteristiche distinte di DELLA. Ancu se a maiò parte di i partenarii di fattore di trascrizione si uniscenu à i domini LHR1 è SAW di DELLA26,51, alcuni aminoacidi conservati in u duminiu PFYRE ponu aiutà à stabilizà queste interazzione.
U sviluppu di l'internode hè un trattu chjave in l'architettura di a pianta è a migliione di u rendiment. qmRGA hà revelatu una attività di signalazione GA più alta in e cellule progenitrici di internode IPR. Cumminendu l'imaghjini quantitativi è a genetica, avemu dimustratu chì i mudelli di signalazione GA sovrapponiscenu piani di divisione cellulare circulari / trasversali in l'epidermisa SAM, furmendu l'urganizazione di divisione cellulare necessaria per u sviluppu di l'internode. Diversi regulatori di l'orientazione di u pianu di a divisione cellulare sò stati identificati durante u sviluppu52,53. U nostru travagliu furnisce un esempiu chjaru di cumu l'attività di signalazione GA regula stu paràmetru cellulare. DELLA pò interagisce cù cumplessi di proteine prefolding41, cusì a signalazione GA pò regulà l'orientazione di u pianu di a divisione cellulare influenzendu direttamente l'orientazione di i microtubuli corticali40,41,54,55. Avemu dimustratu inaspettatamente chì in SAM, u correlate di l'attività di signalazione GA più alta ùn era micca l'allungamentu o a divisione cellulare, ma solu l'anisotropia di crescita, chì hè coherente cù un effettu direttu di GA nantu à a direzzione di a divisione cellulare in l'IPR. In ogni casu, ùn pudemu micca escludiri chì questu effettu puderia ancu esse indirettu, per esempiu mediatu da l'ammollimentu di a parete cellulare indotta da GA56. I cambiamenti in e proprietà di u muru di a cellula inducenu un stress meccanicu57,58, chì pò ancu influenzà l'orientazione di u pianu di a divisione cellulare affettendu l'orientazione di i microtubuli corticali39,46,59. L'effetti cumminati di u stress meccanicu indottu da GA è a regulazione diretta di l'orientazione di i microtubuli da GA ponu esse implicati in a generazione di un mudellu specificu di l'orientazione di a divisione cellulare in l'IPR per definisce l'internodi, è più studii sò necessarii per pruvà sta idea. In listessu modu, studii precedenti anu evidenziatu l'impurtanza di e proteine interagisce cù DELLA TCP14 è 15 in u cuntrollu di a furmazione di l'internode60,61 è questi fattori ponu mediate l'azzione di GA inseme cù BREVIPEDICELLUS (BP) è PENNYWISE (PNY), chì regulanu u sviluppu di l'internode è sò stati dimustrati per influenzà a signalazione GA2,62. Siccomu i DELLA interagiscenu cù i camini di signalazione di brassinosteroide, etilene, acidu jasmonicu è acidu abscisicu (ABA)63,64 è chì queste hormone ponu influenzà l'orientazione di i microtubuli65, l'effetti di GA nantu à l'orientazione di a divisione cellulare pò ancu esse mediati da altre hormone.
I primi studii citologichi anu dimustratu chì e regioni internu è esternu di l'Arabidopsis SAM sò necessarii per u sviluppu di l'internode2,42. U fattu chì GA regula attivamente a divisione cellulare in i tissuti internu12 sustene una doppia funzione di GA in a regulazione di a dimensione di meristema è internode in u SAM. U mudellu di a divisione cellula direzzione hè ancu strettamente regulatu in u tissutu SAM internu, è sta regulazione hè essenziale per a crescita di stem52. Serà interessante per esaminà se GA ghjoca ancu un rolu in l'orientazione di u pianu di a divisione cellulare in l'urganizazione SAM interna, sincronizendu cusì l'specificazione è u sviluppu di l'internodi in u SAM.
I pianti sò stati cultivati in vitro in terra o 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) supplementatu cù 1% saccharose è 1% agar (Sigma) in cundizioni standard (16 h di luce, 22 ° C), eccettu per l'esperimenti di crescita di l'ipocotile è di e radiche in quale e piantini sò stati cultivati nantu à platti verticali sottu a luce constante è 22 ° C. Per l'esperimenti di nitrati, i pianti sò stati cultivati nantu à u mediu MS mudificatu (mediu di pianta bioWORLD) supplementatu cù nitrate adattatu (0 o 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% saccharose è 1% A-agar (Sigma) in cundizioni di longu ghjornu.
GID1a cDNA inseritu in pDONR221 hè stata ricombinata cù pDONR P4-P1R-pUBQ10 è pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW per generà pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA inseritu in pDONR221 hè statu ricombinatu in pB7RWG266 per generà p35S: IDD2-RFP. Per generà pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b, un frammentu di 3,9 kb a monte di a regione di codifica GID1b è un frammentu di 4,7 kb chì cuntene u cDNA GID1b (1,3 kb) è u terminatore (3,4 kb) sò stati prima amplificati utilizendu i primers in a Tabella Supplementaria P1R è poi PR4 inserita in Tabella P1R è PR4. Scientific) è pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), rispettivamente, è infine ricombinatu cù pDONR221 2xmTQ268 in u vettore di destinazione pGreen 012567 utilizendu a clonazione Gateway. Per generà pCUC2::LSSmOrange, a sequenza di promotore CUC2 (3229 bp a monte di ATG) seguita da a sequenza di codificazione di grande mOrange Stokes-shifted (LSSmOrange) 69 cù u signale di localizazione nucleare N7 è u terminatore trascrizionale NOS sò stati assemblati in u pGreen u sistema di recombinazione di kanamycin di destinazione di u sistema di kanamycin 3. (Invitrogenu). U vettore binariu di a pianta hè statu introduttu in Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 è intruduttu in foglie Nicotiana benthamiana da u metudu d'infiltrazione Agrobacterium è in Arabidopsis thaliana Col-0 da u metudu floral dip, rispettivamente. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry è pCLV3::mCherry-NLS qmRGA sò stati isolati da e progenie F3 è F1 di i rispettivi croci, rispettivamente.
L'ibridazione in situ di l'RNA hè stata realizata nantu à circa 1 cm long shoot tips72, chì sò stati raccolti è immediatamente fissati in suluzione FAA (3.7% formaldehyde, 5% acid acetic, 50% etanol) pre-cooled à 4 ° C. Dopu à i trattamenti di vacuum 2 × 15 min, u fissativu hè statu cambiatu è i mostri sò stati incubati per a notte. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 è RGL3 cDNAs è sonde antisensu à i so 3′-UTR sò stati sintetizzati cù i primers mostrati in a Tabella Supplementaria 3 cum'è descritta da Rosier et al.73. Le sonde marcate con digoxigenina sono state immunodetected usando anticorpi digoxigenina (diluizione di 3000 volte; Roche, numero di catalogo: 11 093 274 910), e le sezioni sono state colorate con 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, 250-dibluetrazol, NBIP, 250 volte) diluzione di 200 volte).
Tempu di Postu: Feb-10-2025