A crescita di u meristema apicale di i germogli (SAM) hè cruciale per l'architettura di u fustu. Ormoni vegetaligibberellineI GA (GA) ghjocanu un rollu chjave in a coordinazione di a crescita di e piante, ma u so rollu in u SAM ferma pocu capitu. Quì, avemu sviluppatu un biosensore raziometricu di a segnalazione GA ingegnerizendu a proteina DELLA per supprime a so funzione regulatoria essenziale in a risposta trascrizionale GA mentre priservemu a so degradazione dopu u ricunniscimentu GA. Dimostremu chì questu biosensore basatu annantu à a degradazione registra accuratamente i cambiamenti in i livelli di GA è in u rilevamentu cellulare durante u sviluppu. Avemu utilizatu questu biosensore per mappà l'attività di segnalazione GA in u SAM. Dimostremu chì i signali GA elevati sò presenti principalmente in e cellule situate trà i primordi d'organi, chì sò precursori di e cellule internodali. Usendu approcci di guadagnu è perdita di funzione, dimostremu ancu chì GA regula l'orientazione di u pianu di divisione cellulare, stabilendu l'urganizazione cellulare canonica di l'internodi, prumovendu cusì a specificazione internodale in u SAM.
U meristema apicale di u germoglio (SAM), situatu à l'apice di u germoglio, cuntene una nicchia di cellule staminali chì a so attività genera organi laterali è nodi di u fustu in modu mudulare è iterativu per tutta a vita di a pianta. Ognuna di queste unità ripetute, o nodi di a pianta, include internodi è organi laterali à i nodi, è meristemi ascellari in l'ascelle di e foglie1. A crescita è l'urganizazione di i nodi di a pianta cambianu durante u sviluppu. In Arabidopsis, a crescita internodale hè soppressa durante a fase vegetativa, è i meristemi ascellari restanu dormienti in l'ascelle di e foglie di rosetta. Durante a transizione à a fase floreale, u SAM diventa u meristema di l'infiorescenza, generendu internodi allungati è gemme ascellari, ramoscelli in l'ascelle di e foglie cauline, è più tardi, fiori senza foglie2. Ancu s'è avemu fattu progressi significativi in a comprensione di i meccanismi chì cuntrolanu l'iniziu di foglie, fiori è rami, si sà relativamente pocu nantu à cumu si presentanu l'internodi.
Capisce a distribuzione spatiotempurale di i GA aiuterà à capisce megliu e funzioni di sti ormoni in diversi tessuti è in diverse fasi di sviluppu. A visualizazione di a degradazione di a fusione RGA-GFP espressa sottu l'azione di u so propiu promotore furnisce informazioni impurtanti nantu à a regulazione di i livelli totali di GA in e radiche15,16. Tuttavia, l'espressione di RGA varia trà i tessuti17 è hè regulata da GA18. Cusì, l'espressione differenziale di u promotore RGA pò dà u mudellu di fluorescenza osservatu cù RGA-GFP è dunque stu metudu ùn hè micca quantitativu. Più recentemente, GA19,20 marcatu cù fluoresceina bioattiva (Fl) hà rivelatu l'accumulazione di GA in l'endocorteccia radicale è a regulazione di i so livelli cellulari per mezu di u trasportu GA. Recentemente, u sensore GA FRET nlsGPS1 hà dimustratu chì i livelli di GA sò correlati cù l'allungamentu cellulare in e radiche, i filamenti è l'ipocotili cresciuti à u scuru21. Tuttavia, cum'è avemu vistu, a concentrazione di GA ùn hè micca l'unicu parametru chì cuntrolla l'attività di segnalazione GA, postu chì dipende da prucessi di rilevamentu cumplessi. Quì, basenduci nantu à a nostra cunniscenza di e vie di segnalazione DELLA è GA, riportemu u sviluppu è a caratterizazione di un biosensore raziometricu basatu nantu à a degradazione per a segnalazione GA. Per sviluppà questu biosensore quantitativu, avemu utilizatu un RGA mutante sensibile à GA chì hè statu fusu à una proteina fluorescente è espressu ubiquitariamente in i tessuti, è ancu una proteina fluorescente insensibile à GA. Mostremu chì e fusioni di proteine RGA mutanti ùn interferiscenu micca cù a segnalazione GA endogena quandu sò espresse ubiquitariamente, è chì questu biosensore pò quantificà l'attività di segnalazione risultante sia da l'input GA sia da l'elaborazione di u signale GA da l'apparatu di rilevamentu cù alta risoluzione spatiotempurale. Avemu utilizatu questu biosensore per mappà a distribuzione spatiotempurale di l'attività di segnalazione GA è quantificà cumu GA regula u cumpurtamentu cellulare in l'epidermide SAM. Dimostremu chì GA regula l'orientazione di u pianu di divisione di e cellule SAM situate trà i primordi d'organi, definendu cusì l'urganizazione cellulare canonica di l'internodu.
Infine, avemu dumandatu s'ellu qmRGA puderia signalà cambiamenti in i livelli endogeni di GA aduprendu ipocotili in crescita. Avemu dimustratu prima chì u nitratu stimula a crescita aumentendu a sintesi di GA è, à u so tornu, a degradazione di DELLA34. Di cunsiguenza, avemu osservatu chì a lunghezza di l'ipocotile in e piantine pUBQ10::qmRGA cultivate sottu un abbundante approvvigionamentu di nitrati (10 mM NO3−) era significativamente più longa chè quella in e piantine cultivate in cundizioni di carenza di nitrati (Figura Supplementare 6a). In cunfurmità cù a risposta di crescita, i signali GA eranu più alti in l'ipocotili di e piantine cultivate sottu cundizioni di 10 mM NO3− chè in e piantine cultivate in assenza di nitrati (Figura Supplementare 6b, c). Cusì, qmRGA permette ancu di monitorà i cambiamenti in a segnalazione GA indotta da cambiamenti endogeni in a cuncentrazione di GA.
Per capisce s'ellu l'attività di segnalazione GA rilevata da qmRGA dipende da a cuncentrazione di GA è da a percezione di GA, cum'è previstu in basa à u disignu di u sensore, avemu analizatu l'espressione di i trè recettori GID1 in i tessuti vegetativi è riproduttivi. In e piantine, a linea reporter GID1-GUS hà dimustratu chì GID1a è c eranu altamente espressi in i cotiledoni (Fig. 3a-c). Inoltre, tutti i trè recettori eranu espressi in e foglie, i primordi di e radiche laterali, e punte di e radiche (eccettu per a cuffia radicale di GID1b) è u sistema vasculare (Fig. 3a-c). In u SAM di l'infiorescenza, avemu rilevatu segnali GUS solu per GID1b è 1c (Fig. Supplementare 7a-c). L'ibridazione in situ hà cunfirmatu questi mudelli d'espressione è hà dimustratu ancu di più chì GID1c era espressu uniformemente à bassi livelli in u SAM, mentre chì GID1b hà dimustratu una espressione più alta à a periferia di u SAM (Fig. Supplementare 7d-l). A fusione traduzionale pGID1b::2xmTQ2-GID1b hà ancu rivelatu una gamma graduata di espressione di GID1b, da una bassa o nulla espressione in u centru di u SAM à una alta espressione à i cunfini di l'organi (Fig. Supplementare 7m). Cusì, i receptori GID1 ùn sò micca distribuiti uniformemente in i tessuti è in i tessuti. In esperimenti successivi, avemu ancu osservatu chì a sovraespressione di GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) hà aumentatu a sensibilità di qmRGA in l'ipocotili à l'applicazione esterna di GA (Fig. 3d, e). In cuntrastu, a fluorescenza misurata da qd17mRGA in l'ipocotile era insensibile à u trattamentu GA3 (Fig. 3f, g). Per entrambi i saggi, e piantine sò state trattate cù alte concentrazioni di GA (100 μM GA3) per valutà u cumpurtamentu rapidu di u sensore, induve a capacità di ligà si à u receptore GID1 hè stata aumentata o persa. Inseme, sti risultati cunfermanu chì u biosensore qmRGA serve una funzione cumminata cum'è sensore GA è GA, è suggerenu chì l'espressione differenziale di u receptore GID1 pò modulà significativamente l'emissività di u sensore.
Finu à oghje, a distribuzione di i signali GA in u SAM ferma pocu chjara. Dunque, avemu utilizatu piante chì esprimenu qmRGA è u reporter di cellule staminali pCLV3::mCherry-NLS35 per calculà carte quantitative à alta risoluzione di l'attività di segnalazione GA, fucalizendu nantu à u stratu L1 (epidermide; Fig. 4a, b, vede Metodi è Metodi Supplementari), postu chì L1 ghjoca un rolu chjave in u cuntrollu di a crescita di SAM36. Quì, l'espressione pCLV3::mCherry-NLS hà furnitu un puntu di riferimentu geometricu fissu per analizà a distribuzione spatiotempurale di l'attività di segnalazione GA37. Ancu s'è GA hè cunsideratu essenziale per u sviluppu di l'organi laterali4, avemu osservatu chì i signali GA eranu bassi in u primordiu floreale (P) à partesi da u stadiu P3 (Fig. 4a, b), mentre chì i ghjovani primordii P1 è P2 avianu una attività moderata simile à quella in a regione cintrali (Fig. 4a, b). Una attività di segnalazione GA più alta hè stata rilevata à i limiti di u primordiu di l'organi, cuminciendu da P1/P2 (à i lati di u cunfine) è righjunghjendu un piccu à P4, è ancu in tutte e cellule di a regione periferica situata trà i primordii (Fig. 4a, b è Fig. Supplementare 8a, b). Questa attività di segnalazione GA più alta hè stata osservata micca solu in l'epidermide, ma ancu in i strati L2 è L3 superiori (Fig. Supplementare 8b). U schema di i signali GA rilevati in u SAM utilizendu qmRGA hè ancu rimasu invariatu in u tempu (Fig. Supplementare 8c-f, k). Ancu s'è a custruzzione qd17mRGA hè stata sistematicamente regulata in calata in u SAM di e piante T3 da cinque linee indipendenti chì avemu carattarizatu in dettagliu, simu stati capaci di analizà i mudelli di fluorescenza ottenuti cù a custruzzione pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. Supplementare 8g-j, l). In questa linea di cuntrollu, solu cambiamenti minori in u rapportu di fluorescenza sò stati rilevati in u SAM, ma in u centru SAM avemu osservatu una diminuzione chjara è inaspettata di VENUS assuciata à TagBFP. Questu cunfirma chì u mudellu di segnalazione osservatu da qmRGA riflette a degradazione dipendente da GA di mRGA-VENUS, ma dimostra ancu chì qmRGA pò sopravvalutà l'attività di segnalazione GA in u centru meristema. In riassuntu, i nostri risultati rivelanu un mudellu di segnalazione GA chì riflette principalmente a distribuzione di i primordi. Questa distribuzione di a regione interprimordiale (IPR) hè dovuta à a graduale stabilimentu di un'alta attività di segnalazione GA trà u primordiu in sviluppu è a regione cintrale, mentre à u listessu tempu l'attività di segnalazione GA in u primordiu diminuisce (Fig. 4c, d).
A distribuzione di i receptori GID1b è GID1c (vede sopra) suggerisce chì l'espressione differenziale di i receptori GA aiuta à furmà u mudellu di l'attività di segnalazione GA in u SAM. Ci simu dumandati s'ellu ci puderia esse implicata l'accumulazione differenziale di GA. Per investigà sta pussibilità, avemu utilizatu u sensore nlsGPS1 GA FRET21. Una frequenza d'attivazione aumentata hè stata rilevata in u SAM di nlsGPS1 trattatu cù 10 μM GA4+7 per 100 min (Fig. Supplementare 9a-e), chì indica chì nlsGPS1 risponde à i cambiamenti in a cuncentrazione di GA in u SAM, cum'è in e radiche21. A distribuzione spaziale di a frequenza d'attivazione di nlsGPS1 hà rivelatu livelli di GA relativamente bassi in i strati esterni di u SAM, ma hà mostratu ch'elli eranu elevati in u centru è à i cunfini di u SAM (Fig. 4e è Fig. Supplementare 9a,c). Questu suggerisce chì GA hè ancu distribuitu in u SAM cù un mudellu spaziale paragunabile à quellu rivelatu da qmRGA. Cum'è approcciu cumplementariu, avemu ancu trattatu u SAM cù GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl solu cum'è cuntrollu negativu. U signale Fl hè statu distribuitu in tuttu u SAM, cumprese a regione cintrali è u primordiu, ancu s'è à una intensità più bassa (Fig. 4j è Fig. Supplementare 10d). In cuntrastu, tutti i trè GA-Fl si sò accumulati specificamente in i cunfini di u primordiu è à diversi gradi in u restu di l'IPR, cù GA7-Fl chì s'accumula in u duminiu più grande in l'IPR (Fig. 4k è Fig. Supplementare 10a,b). A quantificazione di l'intensità di fluorescenza hà rivelatu chì u rapportu di l'intensità IPR à quella senza IPR era più altu in u SAM trattatu cù GA-Fl paragunatu à u SAM trattatu cù Fl (Fig. 4l è Fig. Supplementare 10c). Inseme, questi risultati suggerenu chì GA hè presente à concentrazioni più alte in e cellule IPR chì si trovanu più vicinu à u cunfine di l'organu. Questu suggerisce chì u mudellu di l'attività di segnalazione GA di SAM risulta sia da l'espressione differenziale di i recettori GA sia da l'accumulazione differenziale di GA in e cellule IPR vicinu à i cunfini di l'organi. Cusì, a nostra analisi hà rivelatu un mudellu spatiotempurale inaspettatu di segnalazione GA, cù una attività più bassa in u centru è u primordiu di a SAM è una attività più alta in l'IPR in a regione periferica.
Per capisce u rolu di l'attività di segnalazione GA differenziale in u SAM, avemu analizatu a currelazione trà l'attività di segnalazione GA, l'espansione cellulare è a divisione cellulare utilizendu l'imaghjini time-lapse in tempu reale di u SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Datu u rolu di GA in a regulazione di a crescita, era prevista una currelazione pusitiva cù i parametri di espansione cellulare. Dunque, avemu prima paragunatu e carte di l'attività di segnalazione GA cù e carte di u tassu di crescita di a superficia cellulare (cum'è proxy per a forza di l'espansione cellulare per una data cellula è per e cellule figlie à a divisione) è cù e carte di l'anisotropia di crescita, chì misura a direzionalità di l'espansione cellulare (ancu aduprata quì per una data cellula è per e cellule figlie à a divisione; Fig. 5a,b, vede Metodi è Metodi Supplementari). E nostre carte di u tassu di crescita di a superficia cellulare SAM sò coerenti cù l'osservazioni precedenti38,39, cù tassi di crescita minimi à u cunfine è tassi di crescita massimi in i fiori in sviluppu (Fig. 5a). L'analisi di i cumpunenti principali (PCA) hà dimustratu chì l'attività di segnalazione GA era correlata negativamente cù l'intensità di crescita di a superficia cellulare (Figura 5c). Avemu ancu dimustratu chì l'assi principali di variazione, cumprese l'input di segnalazione GA è l'intensità di crescita, eranu ortogonali à a direzzione determinata da l'alta espressione CLV3, cunfirmendu l'esclusione di e cellule da u centru SAM in l'analisi rimanenti. L'analisi di currelazione di Spearman hà cunfirmatu i risultati PCA (Figura 5d), indicendu chì i signali GA più alti in l'IPR ùn anu micca risultatu in una maggiore espansione cellulare. Tuttavia, l'analisi di currelazione hà rivelatu una ligera currelazione pusitiva trà l'attività di segnalazione GA è l'anisotropia di crescita (Figura 5c, d), suggerendu chì una segnalazione GA più alta in l'IPR influenza a direzzione di a crescita cellulare è possibbilmente a pusizione di u pianu di divisione cellulare.
a, b Carte di calore di a crescita superficiale media (a) è di l'anisotropia di crescita (b) in SAM mediate annantu à sette piante indipendenti (usate cum'è proxies per a forza è a direzzione di l'espansione cellulare, rispettivamente). c L'analisi PCA hà inclusu e seguenti variabili: segnale GA, intensità di crescita superficiale, anisotropia di crescita superficiale è espressione CLV3. U cumpunente PCA 1 era principalmente correlato negativamente cù l'intensità di crescita superficiale è correlato positivamente cù u segnale GA. U cumpunente PCA 2 era principalmente correlato positivamente cù l'anisotropia di crescita superficiale è correlato negativamente cù l'espressione CLV3. E percentuali rapprisentanu a variazione spiegata da ogni cumpunente. d Analisi di currelazione di Spearman trà u segnale GA, l'intensità di crescita superficiale è l'anisotropia di crescita superficiale à scala tissutale escludendu CZ. U numeru à diritta hè u valore rho di Spearman trà duie variabili. L'asterischi indicanu i casi induve a currelazione/currelazione negativa hè assai significativa. e Visualizazione 3D di e cellule Col-0 SAM L1 per microscopia cunfocale. I novi muri cellulari furmati in u SAM (ma micca u primordiu) à 10 h sò culurati secondu i so valori angulari. A barra di culore hè mostrata in l'angulu in fondu à diritta. L'insertu mostra l'imagine 3D currispundente à 0 h. L'esperimentu hè statu ripetutu duie volte cù risultati simili. f I grafichi à scatula mostranu i tassi di divisione cellulare in IPR è non-IPR Col-0 SAM (n = 10 piante indipendenti). A linea centrale mostra a mediana, è i limiti di a scatula indicanu u 25u è u 75u percentile. I whiskers indicanu i valori minimi è massimi determinati cù u software R. I valori P sò stati ottenuti cù u test t à duie code di Welch. g, h Schema chì mostra (g) cumu misurà l'angulu di a nova parete cellulare (magenta) rispettu à a direzzione radiale da u centru di u SAM (linea punteggiata bianca) (solu i valori di l'angulu acutu, vale à dì, 0-90°, sò cunsiderati), è (h) e direzzione circunferenziali/laterali è radiali in u meristema. i Istogrammi di frequenza di l'orientazione di u pianu di divisione cellulare attraversu u SAM (blu scuru), IPR (blu mediu) è non-IPR (blu chjaru), rispettivamente. I valori P sò stati ottenuti da un test di Kolmogorov-Smirnov à duie code. L'esperimentu hè statu ripetutu duie volte cù risultati simili. j Istogrammi di frequenza di l'orientazione di u pianu di divisione cellulare di l'IPR intornu à P3 (verde chjaru), P4 (verde mediu) è P5 (verde scuru), rispettivamente. I valori P sò stati ottenuti da un test di Kolmogorov-Smirnov à duie code. L'esperimentu hè statu ripetutu duie volte cù risultati simili.
Dunque, avemu dopu investigatu a currelazione trà a segnalazione GA è l'attività di divisione cellulare identificendu i muri cellulari appena furmati durante u test (Fig. 5e). Questu approcciu ci hà permessu di misurà a frequenza è a direzzione di a divisione cellulare. Sorprendentemente, avemu trovu chì a frequenza di e divisioni cellulari in l'IPR è u restu di u SAM (non-IPR, Fig. 5f) era simile, ciò chì indica chì e differenze in a segnalazione GA trà e cellule IPR è non-IPR ùn influenzanu micca significativamente a divisione cellulare. Questu, è a currelazione pusitiva trà a segnalazione GA è l'anisotropia di crescita, ci anu incitatu à cunsiderà se l'attività di segnalazione GA puderia influenzà l'orientazione di u pianu di divisione cellulare. Avemu misuratu l'orientazione di a nova parete cellulare cum'è un angulu acutu in relazione à l'asse radiale chì cunnetta u centru di u meristema è u centru di a nova parete cellulare (Fig. 5e-i) è avemu osservatu una chiara tendenza di e cellule à dividissi à anguli vicini à 90° in relazione à l'asse radiale, cù e frequenze più alte osservate à 70-80° (23,28%) è 80-90° (22,62%) (Fig. 5e,i), currispondenti à e divisioni cellulari in a direzzione circunferenziale/trasversale (Fig. 5h). Per esaminà u cuntributu di a segnalazione GA à questu cumpurtamentu di divisione cellulare, avemu analizatu i parametri di divisione cellulare in l'IPR è in u non-IPR separatamente (Fig. 5i). Avemu osservatu chì a distribuzione di l'anguli di divisione in e cellule IPR era diversa da quella in e cellule non-IPR o in e cellule in tuttu u SAM, cù e cellule IPR chì mostranu una proporzione più alta di divisioni cellulari laterali/circulari, vale à dì, 70-80° è 80-90° (33,86% è 30,71%, rispettivamente, proporzioni currispondenti) (Fig. 5i). Cusì, e nostre osservazioni anu rivelatu una associazione trà una alta segnalazione GA è un orientamentu di u pianu di divisione cellulare vicinu à a direzzione circunferenziale, simile à a currelazione trà l'attività di segnalazione GA è l'anisotropia di crescita (Fig. 5c, d). Per stabilisce ulteriormente a cunservazione spaziale di sta associazione, avemu misuratu l'orientazione di u pianu di divisione in e cellule IPR chì circundanu u primordiu partendu da P3, postu chì a più alta attività di segnalazione GA hè stata rilevata in questa regione partendu da P4 (Fig. 4). L'anguli di divisione di l'IPR intornu à P3 è P4 ùn anu mostratu differenze statisticamente significative, ancu s'è una maggiore frequenza di divisioni cellulari laterali hè stata osservata in l'IPR intornu à P4 (Fig. 5j). Tuttavia, in e cellule IPR intornu à P5, a differenza in l'orientazione di u pianu di divisione cellulare hè diventata statisticamente significativa, cù un forte aumentu di a frequenza di e divisioni cellulari trasversali (Fig. 5j). Inseme, questi risultati suggerenu chì a segnalazione GA pò cuntrullà l'orientazione di e divisioni cellulari in u SAM, ciò chì hè coerente cù i rapporti precedenti40,41 chì una alta segnalazione GA pò induce l'orientazione laterale di e divisioni cellulari in l'IPR.
Si prevede chì e cellule in l'IPR ùn saranu micca incorporate in i primordi ma piuttostu in l'internodi2,42,43. L'orientazione trasversale di e divisioni cellulari in l'IPR pò dà locu à l'urganizazione tipica di file longitudinali parallele di cellule epidermiche in l'internodi. E nostre osservazioni descritte sopra suggerenu chì a segnalazione GA ghjoca probabilmente un rolu in questu prucessu regulendu a direzzione di a divisione cellulare.
A perdita di funzione di parechji geni DELLA provoca una risposta GA custitutiva, è i mutanti della ponu esse aduprati per pruvà sta ipotesi44. Avemu prima analizatu i mudelli d'espressione di cinque geni DELLA in u SAM. A fusione trascrizionale di a linea GUS45 hà rivelatu chì GAI, RGA, RGL1 è RGL2 (in una misura assai minore) eranu espressi in u SAM (Fig. Supplementare 11a-d). L'ibridazione in situ hà ancu dimustratu chì l'mRNA GAI s'accumula specificamente in i primordi è in i fiori in sviluppu (Fig. Supplementare 11e). L'mRNA RGL1 è RGL3 sò stati rilevati in tutta a chioma di u SAM è in i fiori più vechji, mentre chì l'mRNA RGL2 era più abbundante in a regione di cunfine (Fig. Supplementare 11f-h). L'imaghjini cunfocale di pRGL3::RGL3-GFP SAM hà cunfirmatu l'espressione osservata da l'ibridazione in situ è hà dimustratu chì a proteina RGL3 s'accumula in a parte centrale di u SAM (Fig. Supplementare 11i). Usendu a linea pRGA::GFP-RGA, avemu ancu trovu chì a proteina RGA s'accumula in u SAM, ma a so abbundanza diminuisce à u cunfine à partesi da P4 (Fig. Supplementare 11j). In particulare, i mudelli d'espressione di RGL3 è RGA sò coerenti cù una più alta attività di segnalazione GA in l'IPR, cum'è rilevata da qmRGA (Fig. 4). Inoltre, questi dati indicanu chì tutti i DELLA sò espressi in u SAM è chì a so espressione si estende cullettivamente à tuttu u SAM.
Dopu, avemu analizatu i parametri di divisione cellulare in u SAM di tipu salvaticu (Ler, cuntrollu) è i mutanti gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Fig. 6a, b). Hè interessante nutà chì avemu osservatu un cambiamentu statisticu significativu in a distribuzione di e frequenze di l'anguli di divisione cellulare in u SAM mutante della globale paragunatu à u tipu salvaticu (Fig. 6c). Stu cambiamentu in u mutante della globale era duvutu à un aumentu di a frequenza di l'anguli di 80-90° (34,71% vs. 24,55%) è, in misura minore, di l'anguli di 70-80° (23,78% vs. 20,18%), vale à dì, currispondenti à e divisioni cellulari trasversali (Fig. 6c). A frequenza di e divisioni non trasversali (0-60°) era ancu più bassa in u mutante della globale (Fig. 6c). A frequenza di e divisioni cellulari trasversali era significativamente aumentata in u SAM di u mutante della globale (Fig. 6b). A frequenza di e divisioni cellulari trasversali in l'IPR era ancu più alta in u mutante della globale paragunatu à u tipu salvaticu (Fig. 6d). Fora di a regione IPR, u tipu salvaticu avia una distribuzione più uniforme di l'anguli di divisione cellulare, mentre chì u mutante della globale preferia divisioni tangenziali cum'è l'IPR (Fig. 6e). Avemu ancu quantificatu l'orientazione di e divisioni cellulari in u SAM di mutanti quintupli di ga2 ossidasi (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, è ga2ox6-2), un sfondate mutante inattivu di GA in u quale GA s'accumula. In cunfurmità cù l'aumentu di i livelli di GA, u SAM di l'infiorescenza mutante quintupla ga2ox era più grande di quellu di Col-0 (Figura Supplementare 12a, b), è paragunatu à Col-0, u SAM quintupla ga2ox hà mostratu una distribuzione distintamente diversa di l'anguli di divisione cellulare, cù a frequenza di l'angulu chì aumenta da 50° à 90°, vale à dì di novu favurendu e divisioni tangenziali (Figura Supplementare 12a-c). Cusì, mostremu chì l'attivazione custitutiva di a segnalazione GA è l'accumulazione di GA inducenu divisioni cellulari laterali in l'IPR è in u restu di u SAM.
a, b Visualizazione 3D di u stratu L1 di Ler (a) culuritu cù PI è di u mutante della glubale (b) SAM cù microscopia cunfocale. I novi muri cellulari furmati in u SAM (ma micca u primordiu) in un periodu di 10 ore sò mostrati è culurati secondu i so valori angulari. L'insertu mostra u SAM à 0 ore. A barra di culore hè visualizata in l'angulu in fondu à diritta. A freccia in (b) indica un esempiu di fugliali cellulari allineati in u mutante della glubale. L'esperimentu hè statu ripetutu duie volte cù risultati simili. paragone di a distribuzione di frequenza di l'orientazioni di u pianu di divisione cellulare in tuttu u SAM (d), IPR (e) è non-IPR (f) trà Ler è della glubale. I valori P sò stati ottenuti cù un test di Kolmogorov-Smirnov à duie code. f, g Visualizazione 3D di l'imaghjini cunfocali di SAM culuritu cù PI di e piante transgeniche Col-0 (i) è pCUC2::gai-1-VENUS (j). I pannelli (a, b) mostranu novi muri cellulari (ma micca primordi) furmati in u SAM in 10 ore. L'esperimentu hè statu ripetutu duie volte cù risultati simili. h-j Paragone di a distribuzione di frequenza di l'orientazioni di u pianu di divisione cellulare situate in tuttu u SAM (h), IPR (i) è non-IPR (j) trà e piante Col-0 è pCUC2::gai-1-VENUS. I valori P sò stati ottenuti aduprendu un test di Kolmogorov-Smirnov à duie code.
Dopu avemu testatu l'effettu di l'inibizione di a segnalazione GA specificamente in l'IPR. À questu scopu, avemu utilizatu u promotore di a tazza di cotiledone 2 (CUC2) per guidà l'espressione di una proteina gai-1 negativa dominante fusa à VENUS (in a linea pCUC2::gai-1-VENUS). In u SAM di tipu salvaticu, u promotore CUC2 guida l'espressione di a maiò parte di l'IPR in u SAM, cumprese e cellule di cunfine, da P4 in avanti, è una espressione specifica simile hè stata osservata in e piante pCUC2::gai-1-VENUS (vede sottu). A distribuzione di l'anguli di divisione cellulare attraversu u SAM o IPR di e piante pCUC2::gai-1-VENUS ùn era micca significativamente diversa da quella di u tipu salvaticu, ancu s'è inaspettatamente avemu trovu chì e cellule senza IPR in queste piante si sò divise à una frequenza più alta di 80-90° (Fig. 6f-j).
Hè statu suggeritu chì a direzzione di a divisione cellulare dipende da a geometria di u SAM, in particulare da a tensione di trazione generata da a curvatura di u tissutu46. Dunque, avemu dumandatu s'è a forma di u SAM era alterata in e piante della globale mutante è pCUC2::gai-1-VENUS. Cum'è riportatu prima12, a dimensione di u SAM mutante della globale era più grande di quella di u tipu salvaticu (Fig. Supplementare 13a, b, d). L'ibridazione in situ di CLV3 è STM RNA hà cunfirmatu l'espansione di u meristema in i mutanti della è hà ancu mostratu l'espansione laterale di a nicchia di e cellule staminali (Fig. Supplementare 13e, f, h, i). Tuttavia, a curvatura di u SAM era simile in i dui genotipi (Fig. Supplementare 13k, m, n, p). Avemu osservatu un aumentu simile di dimensione in u mutante gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple senza un cambiamentu di curvatura paragunatu à u tipu salvaticu (Fig. Supplementare 13c, d, g, j, l, o, p). A frequenza di l'orientazione di a divisione cellulare hè stata ancu affettata in u mutante della quadruple, ma in una misura minore chè in u mutante della monoliticu (Fig. Supplementare 12d-f). Questu effettu di dosaggio, accumpagnatu da a mancanza di un effettu nantu à a curvatura, suggerisce chì l'attività residuale di RGL3 in u mutante Della quadruple limita i cambiamenti in l'orientazione di a divisione cellulare causati da a perdita di l'attività DELLA è chì i cambiamenti in e divisioni cellulari laterali si verificanu in risposta à i cambiamenti in l'attività di segnalazione GA piuttostu chè à i cambiamenti in a geometria SAM. Cum'è descrittu sopra, u promotore CUC2 guida l'espressione di IPR in u SAM cuminciendu da P4 (Fig. Supplementare 14a, b), è in cuntrastu, u pCUC2::gai-1-VENUS SAM avia una dimensione ridutta ma una curvatura più alta (Fig. Supplementare 14c-h). Questu cambiamentu in a morfologia di pCUC2::gai-1-VENUS SAM pò risultà in una distribuzione diversa di e tensioni meccaniche paragunate à u tipu salvaticu, in u quale e tensioni circunferenziali elevate cumincianu à una distanza più corta da u centru SAM47. In alternativa, i cambiamenti in a morfologia di pCUC2::gai-1-VENUS SAM puderanu esse u risultatu di cambiamenti in e proprietà meccaniche regiunale indotte da l'espressione transgenica48. In i dui casi, questu puderia compensà parzialmente l'effetti di i cambiamenti in a segnalazione GA aumentendu a probabilità chì e cellule si dividinu in l'orientazione circunferenziale/trasversale, spiegendu e nostre osservazioni.
Pigliati inseme, i nostri dati cunfermanu chì a segnalazione GA più alta ghjoca un rolu attivu in l'orientazione laterale di u pianu di divisione cellulare in l'IPR. Mostranu ancu chì a curvatura di u meristema influenza ancu l'orientazione di u pianu di divisione cellulare in l'IPR.
L'orientazione trasversale di u pianu di divisione in l'IPR, per via di l'alta attività di segnalazione GA, suggerisce chì GA pre-urganizeghja un schedariu cellulare radiale in l'epidermide in u SAM per definisce l'urganizazione cellulare chì si truverà dopu in l'internodu epidermicu. Infatti, tali schedari cellulari eranu spessu visibili in l'imaghjini SAM di mutanti della globali (Fig. 6b). Cusì, per esplorà ulteriormente a funzione di sviluppu di u mudellu spaziale di a segnalazione GA in u SAM, avemu utilizatu l'imaghjini time-lapse per analizà l'urganizazione spaziale di e cellule in l'IPR in piante di tipu salvaticu (Ler è Col-0), mutanti della globali è piante transgeniche pCUC2::gai-1-VENUS.
Avemu trovu chì qmRGA hà dimustratu chì l'attività di segnalazione GA in l'IPR hè aumentata da P1/P2 è hà righjuntu u piccu à P4, è questu mudellu hè restatu custante in u tempu (Fig. 4a-f è Fig. Supplementare 8c-f, k). Per analizà l'urganizazione spaziale di e cellule in l'IPR cù l'aumentu di u signale GA, avemu etichettatu e cellule Ler IPR sopra è à i lati di P4 secondu u so destinu di sviluppu analizatu 34 ore dopu a prima osservazione, vale à dì, più di duie volte plastidiche, chì ci permette di seguità e cellule IPR durante u sviluppu di u primordiu da P1/P2 à P4. Avemu utilizatu trè culori diversi: giallu per quelle cellule chì sò state integrate in u primordiu vicinu à P4, verde per quelle chì eranu in l'IPR, è viola per quelle chì anu participatu à i dui prucessi (Fig. 7a-c). À t0 (0 h), 1-2 strati di cellule IPR eranu visibili davanti à P4 (Fig. 7a). Cum'è previstu, quandu queste cellule si sò divise, l'anu fattu principalmente via u pianu di divisione trasversale (Fig. 7a-c). Risultati simili sò stati ottenuti aduprendu Col-0 SAM (cuncentrandosi nantu à P3, chì u so bordu si piega in modu simile à P4 in Ler), ancu s'è in questu genotipu a piega furmata à u bordu fiurale hà piattu e cellule IPR più rapidamente (Fig. 7g-i). Cusì, u schema di divisione di e cellule IPR pre-urganizeghja e cellule in file radiali, cum'è in l'internodi. L'urganizazione di e file radiali è a lucalizazione di e cellule IPR trà l'organi successivi suggerenu chì queste cellule sò progenitori internodali.
Quì, avemu sviluppatu un biosensore di segnalazione GA raziometrica, qmRGA, chì permette a mappatura quantitativa di l'attività di segnalazione GA risultante da concentrazioni combinate di GA è recettori GA mentre minimizza l'interferenza cù e vie di segnalazione endogene, furnendu cusì informazioni nantu à a funzione GA à u livellu cellulare. À questu scopu, avemu custruitu una proteina DELLA mudificata, mRGA, chì hà persu a capacità di ligà i partenarii d'interazzione DELLA ma ferma sensibile à a proteolisi indotta da GA. qmRGA risponde à i cambiamenti sia esogeni sia endogeni in i livelli di GA, è e so proprietà di rilevamentu dinamicu permettenu a valutazione di i cambiamenti spatiotemporali in l'attività di segnalazione GA durante u sviluppu. qmRGA hè ancu un strumentu assai flessibile postu chì pò esse adattatu à diversi tessuti cambiendu u promotore utilizatu per a so espressione (se necessariu), è data a natura cunservata di a via di segnalazione GA è u mutivu PFYRE in l'angiosperme, hè prubabile chì sia trasferibile à altre spezie22. In cunfurmità cù questu, una mutazione equivalente in a proteina DELLA di u risu SLR1 (HYY497AAA) hè stata ancu dimustrata per supprime l'attività di repressore di a crescita di SLR1 mentre riduce solu ligeramente a so degradazione mediata da GA, simile à mRGA23. In particulare, studii recenti in Arabidopsis anu dimustratu chì una sola mutazione di aminoacidi in u duminiu PFYRE (S474L) hà alteratu l'attività trascrizionale di RGA senza affettà a so capacità di interagisce cù i partenarii di fattori di trascrizione50. Ancu s'è sta mutazione hè assai vicina à e 3 sustituzioni di aminoacidi presenti in mRGA, i nostri studii mostranu chì queste duie mutazioni alteranu caratteristiche distinte di DELLA. Ancu s'è a maiò parte di i partenarii di fattori di trascrizione si leganu à i duminii LHR1 è SAW di DELLA26,51, alcuni aminoacidi cunservati in u duminiu PFYRE ponu aiutà à stabilizà queste interazzione.
U sviluppu di l'internodu hè una caratteristica chjave in l'architettura di e piante è u miglioramentu di u rendimentu. qmRGA hà rivelatu una attività di segnalazione GA più elevata in e cellule progenitrici di l'internodu IPR. Cumbinendu l'imaghjini quantitative è a genetica, avemu dimustratu chì i mudelli di segnalazione GA sovrappongono piani di divisione cellulare circulari/trasversali in l'epidermide SAM, furmendu l'urganizazione di a divisione cellulare necessaria per u sviluppu di l'internodu. Parechji regulatori di l'orientazione di u pianu di divisione cellulare sò stati identificati durante u sviluppu52,53. U nostru travagliu furnisce un esempiu chjaru di cume l'attività di segnalazione GA regula questu parametru cellulare. DELLA pò interagisce cù i cumplessu proteichi di pre-ripiegamentu41, dunque a segnalazione GA pò regulà l'orientazione di u pianu di divisione cellulare influenzendu direttamente l'orientazione di i microtubuli corticali40,41,54,55. Avemu dimustratu inaspettatamente chì in SAM, u currelatu di una attività di segnalazione GA più elevata ùn era micca l'allungamentu o a divisione cellulare, ma solu l'anisotropia di crescita, chì hè coerente cù un effettu direttu di GA nantu à a direzzione di a divisione cellulare in l'IPR. Tuttavia, ùn pudemu micca escludere chì questu effettu puderia ancu esse indirettu, per esempiu mediatu da l'ammorbidimentu di a parete cellulare induttu da GA56. I cambiamenti in e proprietà di a parete cellulare inducenu stress meccanicu57,58, chì pò ancu influenzà l'orientazione di u pianu di divisione cellulare affettendu l'orientazione di i microtubuli corticali39,46,59. L'effetti cumminati di u stress meccanicu induttu da GA è a regulazione diretta di l'orientazione di i microtubuli da GA ponu esse implicati in a generazione di un mudellu specificu di orientazione di a divisione cellulare in l'IPR per definisce l'internodi, è sò necessarii ulteriori studii per testà sta idea. In listessu modu, studii precedenti anu messu in risaltu l'impurtanza di e proteine TCP14 è 15 chì interagiscenu cù DELLA in u cuntrollu di a furmazione di l'internodi60,61 è questi fattori ponu medià l'azione di GA inseme cù BREVIPEDICELLUS (BP) è PENNYWISE (PNY), chì regulanu u sviluppu di l'internodi è hè statu dimustratu chì influenzanu a segnalazione GA2,62. Datu chì i DELLA interagiscenu cù e vie di segnalazione di brassinosteroidi, etilene, acidu jasmonicu è acidu abscissicu (ABA)63,64 è chì questi ormoni ponu influenzà l'orientazione di i microtubuli65, l'effetti di GA nantu à l'orientazione di a divisione cellulare ponu ancu esse mediati da altri ormoni.
I primi studii citologichi anu dimustratu chì e regioni interne è esterne di u SAM d'Arabidopsis sò necessarie per u sviluppu di l'internodi2,42. U fattu chì GA regula attivamente a divisione cellulare in i tessuti interni12 sustene una doppia funzione di GA in a regulazione di a dimensione di u meristema è di l'internodi in u SAM. U mudellu di divisione cellulare direzionale hè ancu strettamente regulatu in u tissutu SAM internu, è sta regulazione hè essenziale per a crescita di u stelu52. Serà interessante esaminà se GA ghjoca ancu un rolu in l'orientazione di u pianu di divisione cellulare in l'urganizazione SAM interna, sincronizendu cusì a specificazione è u sviluppu di l'internodi in u SAM.
E piante sò state cultivate in vitro in terra o in un mediu 1x Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) supplementatu cù 1% di saccarosu è 1% d'agar (Sigma) in cundizioni standard (16 ore di luce, 22 °C), eccettu per l'esperimenti di crescita di l'ipocotile è di e radiche in i quali e piantine sò state cultivate nantu à piastre verticali sottu luce costante è 22 °C. Per l'esperimenti di nitrati, e piante sò state cultivate nantu à un mediu MS mudificatu (mediu per piante bioWORLD) supplementatu cù nitrati adeguati (0 o 10 mM KNO3), 0,5 mM di NH4-succinatu, 1% di saccarosu è 1% d'agar A (Sigma) in cundizioni di ghjornu longu.
U cDNA di GID1a inseritu in pDONR221 hè statu ricombinatu cù pDONR P4-P1R-pUBQ10 è pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW per generà pUBQ10::GID1a-mCherry. U DNA IDD2 inseritu in pDONR221 hè statu ricombinatu in pB7RWG266 per generà p35S:IDD2-RFP. Per generà pGID1b::2xmTQ2-GID1b, un fragmentu di 3,9 kb à monte di a regione codificante GID1b è un fragmentu di 4,7 kb chì cuntene u cDNA GID1b (1,3 kb) è u terminatore (3,4 kb) sò stati prima amplificati utilizendu i primer in a Tabella Supplementare 3 è dopu inseriti in pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) è pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), rispettivamente, è infine ricombinati cù pDONR221 2xmTQ268 in u vettore target pGreen 012567 utilizendu a clonazione Gateway. Per generà pCUC2::LSSmOrange, a sequenza di u promotore CUC2 (3229 bp à monte di ATG) seguita da a sequenza codificante di u grande mOrange spostatu da Stokes (LSSmOrange)69 cù u signale di lucalizazione nucleare N7 è u terminatore trascrizionale NOS sò stati assemblati in u vettore di targeting di a kanamicina pGreen utilizendu u sistema di ricombinazione Gateway à 3 frammenti (Invitrogen). U vettore binariu di a pianta hè statu introduttu in a ceppa GV3101 di Agrobacterium tumefaciens è introduttu in e foglie di Nicotiana benthamiana per mezu di u metudu di infiltrazione di Agrobacterium è in Arabidopsis thaliana Col-0 per mezu di u metudu di immersione fiorale, rispettivamente. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry è pCLV3::mCherry-NLS qmRGA sò stati isolati da e progenie F3 è F1 di i rispettivi incroci, rispettivamente.
L'ibridazione in situ di l'ARN hè stata realizata nantu à punte di germogli di circa 1 cm di lunghezza72, chì sò state raccolte è immediatamente fissate in una soluzione FAA (3,7% formaldeide, 5% acidu aceticu, 50% etanolu) pre-raffreddata à 4 °C. Dopu à 2 trattamenti à u vacuum di 15 minuti, u fissativu hè statu cambiatu è i campioni sò stati incubati durante a notte. I cDNA di GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 è RGL3 è e sonde antisenso per i so 3'-UTR sò state sintetizate utilizendu i primer mostrati in a Tabella Supplementare 3 cum'è descrittu da Rosier et al.73. E sonde marcate cù a digoxigenina sò state immunodetectate aduprendu anticorpi contr'à a digoxigenina (diluizione 3000 volte; Roche, numeru di catalogu: 11 093 274 910), è e sezioni sò state colorate cù una soluzione di 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfatu (BCIP, diluizione 250 volte)/nitroblu tetrazolium (NBT, diluizione 200 volte).
Data di publicazione: 10 di ferraghju 2025