U nematodu di u pinu hè un endoparassita migratoriu di quarantena cunnisciutu per causà gravi perdite ecunomiche in l'ecosistemi di e pinete. U presente studiu esamina l'attività nematicida di l'indoli alogenati contr'à i nematodi di u pinu è u so mecanismu d'azione. L'attività nematicide di u 5-iodoindolu è di l'avermectina (cuntrollu pusitivu) contr'à i nematodi di u pinu eranu simili è alte à basse concentrazioni (10 μg/mL). U 5-iodoindolu hà riduttu a fecundità, l'attività riproduttiva, a mortalità embrionale è larvale, è u cumpurtamentu locomotore. L'interazzione moleculare di i ligandi cù i recettori di u canale di cloruru glutamatu-dipendente specifichi di l'invertebrati sustenenu l'idea chì u 5-iodoindolu, cum'è l'avermectina, si lega strettamente à u situ attivu di u recettore. U 5-iodoindolu hà ancu induttu varie deformazioni fenotipiche in i nematodi, cumprese u collassu/ritrazione anormale di l'organi è una maggiore vacuolizazione. Questi risultati suggerenu chì i vacuoli possinu ghjucà un rolu in a morte mediata da a metilazione di i nematodi. Impurtantemente, u 5-iodoindolu ùn era micca tossicu per e duie spezie vegetali (cavulu è ravanellu). Cusì, questu studiu dimostra chì l'applicazione di iodoindolu in cundizioni ambientali pò cuntrullà i danni di appassimentu di i pini.
U nematodu di u legnu di pinu (Bursaphelenchus xylophilus) appartene à i nematodi di u legnu di pinu (PWN), nematodi endoparassiti migratori cunnisciuti per causà gravi danni ecologichi à l'ecosistemi di e pinete1. A malatia di l'appassimentu di u pinu (PWD) causata da u nematodu di u legnu di pinu hè diventata un prublema seriu in parechji cuntinenti, cumpresi l'Asia è l'Europa, è in l'America di u Nordu, u nematodu distrugge e spezie di pinu introdutte1,2. U declinu di i pini hè un prublema ecunomicu maiò, è a prospettiva di a so diffusione glubale hè preoccupante3. E seguenti spezie di pinu sò più comunemente attaccate da u nematodu: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii è Pinus radiata4. U nematodu di u pinu hè una malatia seria chì pò tumbà i pini in poche settimane o mesi da l'infezione. Inoltre, l'epidemie di nematodi di u pinu sò cumuni in una varietà di ecosistemi, dunque sò state stabilite catene d'infezione persistenti1.
Bursaphelenchus xylophilus hè un nematodu parassita di e piante di quarantena chì appartene à a superfamiglia Aphelenchoidea è à u clade 102.5. U nematodu si nutrisce di funghi è si riproduce in i tessuti lignei di i pini, sviluppendu si in quattru stadii larvali diversi: L1, L2, L3, L4 è un individuu adultu1,6. In cundizioni di scarsità di cibo, u nematodu di u pinu passa in un stadiu larvale specializatu - dauer, chì parassita u so vettore - u scarabeu di a corteccia di u pinu (Monochamus alternatus) è hè trasferitu à pini sani. In ospiti sani, i nematodi migranu rapidamente attraversu i tessuti vegetali è si nutriscenu di cellule parenchimatose, ciò chì porta à una quantità di reazioni d'ipersensibilità, appassimentu di u pinu è morte in un annu dopu l'infezione1,7,8.
U cuntrollu biologicu di i nematodi di u pinu hè statu longu una sfida, cù misure di quarantena chì datanu di u XXu seculu. E strategie attuali per u cuntrollu di i nematodi di u pinu implicanu principalmente trattamenti chimichi, cumprese a fumigazione di u legnu è l'impiantu di nematocidi in i tronchi d'arburi. I nematocidi più cumunimenti usati sò l'avermectina è u benzoatu d'avermectina, chì appartenenu à a famiglia di l'avermectine. Quessi chimichi cari sò assai efficaci contr'à parechje spezie di nematodi è sò cunsiderati sicuri per l'ambiente9. Tuttavia, si prevede chì l'usu ripetutu di sti nematocidi creerà una pressione di selezzione chì quasi certamente porterà à l'emergenza di nematodi di u pinu resistenti, cum'è hè statu dimustratu per parechji insetti nocivi, cum'è Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella è i nematodi Trichostrongylus colubriformis è Ostertagia circumcincta, chì anu sviluppatu gradualmente resistenza à l'avermectine10,11,12. Dunque, i mudelli di resistenza devenu esse studiati regularmente è i nematocidi screening continuamente per truvà misure alternative, economiche è rispettose di l'ambiente per cuntrullà a PVD. In l'ultimi decennii, parechji autori anu prupostu l'usu di estratti vegetali, olii essenziali è volatili cum'è agenti di cuntrollu di nematodi13,14,15,16.
Avemu dimustratu pocu fà l'attività nematicida di l'indolu, una molécula di segnalazione intercellulare è interregni, in Caenorhabditis elegans 17. L'indolu hè un segnale intracellulare diffusu in l'ecologia microbiana, chì cuntrolla numerose funzioni chì affettanu a fisiologia microbiana, a furmazione di spore, a stabilità di i plasmidi, a resistenza à i farmaci, a furmazione di biofilm è a virulenza 18, 19. L'attività di l'indolu è di i so derivati contr'à altri nematodi patogeni ùn hè stata studiata. In questu studiu, avemu investigatu l'attività nematicida di 34 indoli contr'à i nematodi di u pinu è avemu elucidatu u mecanismu d'azione di u 5-iodoindolu u più putente utilizendu a microscopia, a fotografia time-lapse è l'esperimenti di docking moleculare, è avemu valutatu i so effetti tossichi nantu à e piante utilizendu un test di germinazione di e sementi.
Alte concentrazioni (> 1,0 mM) d'indolu sò state digià signalate per avè un effettu nematicida nantu à i nematodi17. Dopu à u trattamentu di B. xylophilus (stadi di vita misti) cù indolu o 33 derivati indoli diversi à 1 mM, a mortalità di B. xylophilus hè stata misurata cuntendu i nematodi vivi è morti in i gruppi di cuntrollu è trattati. Cinque indoli anu mostratu una attività nematicida significativa; a sopravvivenza di u gruppu di cuntrollu micca trattatu era di 95 ± 7% dopu à 24 ore. Di i 34 indoli testati, u 5-iodoindolu è u 4-fluoroindolu à 1 mM anu causatu una mortalità di u 100%, mentre chì u 5,6-difluoroindigo, u metilindolu-7-carbossilatu è u 7-iodoindolu anu causatu una mortalità di circa u 50% (Tabella 1).
Effettu di u 5-iodoindolu nantu à a furmazione di vacuoli è u metabolismu di u nematodu di u legnu di pinu. (A) Effettu di l'avermectina è di u 5-iodoindolu nantu à i nematodi maschili adulti, (B) ova di nematodi di stadiu L1 è (C) metabolismu di B. xylophilus, (i) i vacuoli ùn sò stati osservati à 0 h, u trattamentu hà risultatu in (ii) vacuoli, (iii) accumulazione di vacuoli multipli, (iv) gonfiore di i vacuoli, (v) fusione di i vacuoli è (vi) furmazione di vacuoli giganti. E frecce rosse indicanu u gonfiore di i vacuoli, e frecce blu indicanu a fusione di i vacuoli è e frecce nere indicanu vacuoli giganti. Barra di scala = 50 μm.
Inoltre, questu studiu hà ancu discrittu u prucessu sequenziale di morte indotta da u metanu in i nematodi di pinu (Figura 4C). A morte metanogenica hè un tipu non apoptoticu di morte cellulare assuciatu à l'accumulazione di vacuoli citoplasmatici prominenti27. I difetti morfologichi osservati in i nematodi di pinu parenu esse strettamente ligati à u mecanismu di morte indotta da u metanu. L'esame microscopicu in tempi diversi hà dimustratu chì i vacuoli giganti sò stati furmati dopu à 20 ore di esposizione à u 5-iodoindolu (0,1 mM). I vacuoli microscopici sò stati osservati dopu à 8 ore di trattamentu, è u so numeru hè aumentatu dopu à 12 ore. Parechji vacuoli grandi sò stati osservati dopu à 14 ore. Parechji vacuoli fusi eranu chjaramente visibili dopu à 12-16 ore di trattamentu, indicendu chì a fusione di i vacuoli hè a basa di u mecanismu di morte metanogenica. Dopu à 20 ore, parechji vacuoli giganti sò stati trovati in tuttu u verme. Queste osservazioni rapprisentanu u primu rapportu di metuosi in C. elegans.
In i vermi trattati cù 5-iodoindolu, sò state osservate ancu l'aggregazione è a rottura di i vacuoli (Fig. 5), cum'è evidenziatu da a piegatura di i vermi è a liberazione di i vacuoli in l'ambiente. A disrupzione di i vacuoli hè stata osservata ancu in a membrana di u gusciu d'ovu, chì hè nurmalmente cunservata intatta da L2 durante a schiusa (Fig. Supplementare S2). Queste osservazioni sustenenu l'implicazione di l'accumulazione di fluidi è di u fallimentu osmoregulatoriu, è ancu di a ferita cellulare reversibile (RCI), in u prucessu di furmazione è suppurazione di i vacuoli (Fig. 5).
Ipotizendu u rolu di u ioduru di sodiu (NaI) è di u ioduru di potassiu (KI). Tuttavia, à cuncentrazioni (0,1, 0,5 o 1 mM), ùn anu micca affettatu nè a sopravvivenza di i nematodi nè a furmazione di vacuoli (Figura Supplementare S5), ancu s'è 1 mM di KI hà avutu un ligeru effettu nematicida. D’altronde, u 7-iodoindolu (1 o 2 mM), cum'è u 5-iodoindolu, hà induttu parechji vacuoli è deformazioni strutturali (Figura Supplementare S6). I dui iodoindoli anu mostratu caratteristiche fenotipiche simili in i nematodi di pinu, mentre chì NaI è KI ùn l'anu micca fattu. Hè interessante nutà chì l'indolu ùn hà micca induttu a furmazione di vacuoli in B. xylophilus à e cuncentrazioni testate (dati micca mostrati). Cusì, i risultati anu cunfirmatu chì u cumplessu indolu-iodu hè rispunsevule di a vacuolizazione è di u metabolismu di B. xylophilus.
Trà l'indoli testati per l'attività nematicida, u 5-iodoindolu avia l'indice di slip più altu di -5,89 kcal/mol, seguitatu da u 7-iodoindolu (-4,48 kcal/mol), u 4-fluoroindolu (-4,33) è l'indolu (-4,03) (Figura 6). U forte ligame à idrogenu di a catena di u 5-iodoindolu à a leucina 218 stabilizza u so ligame, mentre chì tutti l'altri derivati di l'indolu si leganu à a serina 260 via ligami à idrogenu di a catena laterale. Frà altri iodoindoli modellati, u 2-iodoindolu hà un valore di ligame di -5,248 kcal/mol, chì hè duvutu à u so principale ligame à idrogenu cù a leucina 218. Altri ligami cunnisciuti includenu 3-iodoindolu (-4,3 kcal/mol), 4-iodoindolu (-4,0 kcal/mol) è 6-fluoroindolu (-2,6 kcal/mol) (Figura Supplementare S8). A maiò parte di l'indoli alogenati è l'indolu stessu, à l'eccezzione di u 5-iodoindolu è di u 2-iodoindolu, formanu un ligame cù a serina 260. U fattu chì u ligame à l'idrogenu cù a leucina 218 hè indicativu di un ligame efficace trà u receptore è u ligandu, cum'è osservatu per l'ivermectina (Figura Supplementare S7), cunfirma chì u 5-iodoindolu è u 2-iodoindolu, cum'è l'ivermectina, si leganu strettamente à u situ attivu di u receptore GluCL via a leucina 218 (Fig. 6 è Figura Supplementare S8). Prupunemu chì questu ligame hè necessariu per mantene a struttura à pori aperti di u cumplessu GluCL è chì, ligendusi strettamente à u situ attivu di u receptore GluCL, u 5-iodoindolu, u 2-iodoindolu, l'avermectina è l'ivermectina mantenenu cusì u canale ionicu apertu è permettenu l'assorbimentu di fluidi.
Attraccu moleculare di indolu è indolu alogenatu à GluCL. Orientazioni di ligame di i ligandi (A) indolu, (B) 4-fluoroindolu, (C) 7-iodoindolu, è (D) 5-iodoindolu à u situ attivu di GluCL. A proteina hè rapprisintata da un nastru, è i ligami à l'idrogenu di a catena principale sò mostrati cum'è linee punteggiate gialle. (A′), (B′), (C′) è (D′) mostranu l'interazzione di i ligandi currispondenti cù i residui di aminoacidi circundanti, è i ligami à l'idrogenu di a catena laterale sò indicati da frecce punteggiate rosa.
Esperimenti sò stati realizati per valutà l'effettu tossicu di u 5-iodoindolu nantu à a germinazione di e sementi di cavulu è di ravanellu. U 5-iodoindolu (0,05 o 0,1 mM) o l'avermectina (10 μg/mL) anu avutu pocu o nisun effettu nantu à a germinazione iniziale è l'emergenza di e piantine (Figura 7). Inoltre, ùn hè stata trovata alcuna differenza significativa trà u tassu di germinazione di i cuntrolli micca trattati è e sementi trattate cù 5-iodoindolu o avermectina. L'effettu nantu à l'allungamentu di u fittone è u numeru di radiche laterali furmate era insignificante, ancu s'è 1 mM (10 volte a so cuncentrazione attiva) di 5-iodoindolu hà ritardatu ligeramente u sviluppu di e radiche laterali. Quessi risultati indicanu chì u 5-iodoindolu ùn hè micca tossicu per e cellule vegetali è ùn interferisce micca cù i prucessi di sviluppu di e piante à e cuncentrazioni studiate.
Effettu di u 5-iodoindolu nantu à a germinazione di e sementi. Germinazione, germinazione è radicamentu laterale di e sementi di B. oleracea è R. raphanistrum nantu à u mediu d'agar Murashige è Skoog cù o senza avermectina o 5-iodoindolu. A germinazione hè stata registrata dopu à 3 ghjorni d'incubazione à 22°C.
Stu studiu riporta parechji casi di uccisione di nematodi da indoli. Impurtantemente, questu hè u primu rapportu di iodoindole chì induce metilazione (un prucessu causatu da l'accumulazione di picculi vacuoli chì si fundenu gradualmente in vacuoli giganti, purtendu infine à a rottura di a membrana è a morte) in aghi di pinu, cù l'iodoindole chì mostra proprietà nematicide significative simili à quelle di u nematicida cummerciale avermectina.
L'indoli sò stati digià signalati per esercità parechje funzioni di segnalazione in procarioti è eucarioti, cumprese l'inibizione / furmazione di biofilm, a sopravvivenza batterica è a patogenicità 19,32,33,34. Recentemente, i potenziali effetti terapeutici di l'indoli alogenati, l'alcaloidi indolici è i derivati semisintetici di l'indoli anu suscitatu un grande interessu di ricerca 35,36,37. Per esempiu, hè statu dimustratu chì l'indoli alogenati uccidenu e cellule persistenti di Escherichia coli è Staphylococcus aureus 37. Inoltre, hè di interessu scientificu studià l'efficacia di l'indoli alogenati contr'à altre spezie, generi è regni, è questu studiu hè un passu versu u raggiungimentu di questu scopu.
Quì, pruponemu un mecanismu per a letalità indotta da u 5-iodoindolu in C. elegans basatu annantu à a ferita cellulare reversibile (RCI) è a metilazione (Figure 4C è 5). I cambiamenti edematosi cum'è u gonfiore è a degenerazione vacuolare sò indicatori di RCI è metilazione, manifestati cum'è vacuoli giganti in u citoplasma48,49. RCI interferisce cù a pruduzzione di energia riducendu a pruduzzione di ATP, causendu u fallimentu di a pompa ATPasi, o interrompendu e membrane cellulari è causendu un afflussu rapidu di Na+, Ca2+ è acqua50,51,52. I vacuoli intracitoplasmatici si presentanu in e cellule animali per via di l'accumulazione di fluidi in u citoplasma per via di l'afflussu di Ca2+ è acqua53. Curiosamente, questu mecanismu di danni cellulari hè reversibile se u dannu hè tempurale è e cellule cumincianu à pruduce ATP per un certu periodu di tempu, ma se u dannu persiste o peghju, e cellule morenu.54 E nostre osservazioni mostranu chì i nematodi trattati cù 5-iodoindole ùn sò micca capaci di restaurà a biosintesi nurmale dopu l'esposizione à cundizioni di stress.
U fenotipu di metilazione induttu da u 5-iodoindolu in B. xylophilus pò esse duvutu à a presenza di iodu è à a so distribuzione moleculare, postu chì u 7-iodoindolu hà avutu menu effettu inhibitoriu annantu à B. xylophilus chè u 5-iodoindolu (Tabella 1 è Figura Supplementare S6). Quessi risultati sò parzialmente coerenti cù i studii di Maltese et al. (2014), chì anu riportatu chì a traslocazione di a parte di azotu piridilico in l'indolu da a pusizione para à a pusizione meta hà abulitu a vacuolizazione, l'inibizione di a crescita è a citotossicità in e cellule U251, suggerendu chì l'interazzione di a molecule cù un situ attivu specificu in a proteina hè critica27,44,45. L'interazzione trà l'indolu o l'indoli alogenati è i recettori GluCL osservati in questu studiu sustenenu ancu sta nuzione, postu chì u 5- è u 2-iodoindolu si leganu à i recettori GluCL più forte chè l'altri indoli esaminati (Figura 6 è Figura Supplementare S8). L'iodu à a seconda o quinta pusizione di l'indolu hè statu trovu à ligà si à a leucina 218 di u receptore GluCL per via di ligami d'idrogenu di a catena principale, mentre chì altri indoli alogenati è l'indolu stessu formanu ligami d'idrogenu di catena laterale debuli cù a serina 260 (Figura 6). Dunque, ipotemu chì a lucalizazione di l'alogenu ghjoca un rolu impurtante in l'induzione di a degenerazione vacuolare, mentre chì u ligame strettu di u 5-iodoindolu mantene u canale ionicu apertu, permettendu cusì un afflussu rapidu di fluidi è a rottura di u vacuolu. Tuttavia, u mecanismu d'azione dettagliatu di u 5-iodoindolu ferma da determinà.
Prima di l'applicazione pratica di u 5-iodoindolu, u so effettu tossicu nantu à e piante deve esse analizatu. I nostri esperimenti di germinazione di e sementi anu dimustratu chì u 5-iodoindolu ùn hà avutu alcun effettu negativu nantu à a germinazione di e sementi o i prucessi di sviluppu successivi à e concentrazioni studiate (Figura 7). Cusì, questu studiu furnisce una basa per l'usu di u 5-iodoindolu in l'ambiente ecologicu per cuntrullà a nocività di i nematodi di u pinu per i pini.
Rapporti precedenti anu dimustratu chì a terapia basata nantu à l'indolu rapprisenta un approcciu putenziale per affruntà u prublema di a resistenza à l'antibiotici è a progressione di u cancru55. Inoltre, l'indoli pussedenu attività antibatteriche, anticancerose, antioxidanti, antiinflamatorie, antidiabetiche, antivirali, antiproliferative è antitubercolari è ponu serve cum'è una basa promettente per u sviluppu di farmaci56,57. Questu studiu suggerisce per a prima volta l'usu putenziale di u iodu cum'è agente antiparassitariu è antielminticu.
L'avermectina hè stata scuperta trè decennii fà è hà vintu u Premiu Nobel in u 2015, è u so usu cum'è antielminticu hè sempre attivamente in corsu. Tuttavia, per via di u rapidu sviluppu di a resistenza à l'avermectine in i nematodi è i parassiti di l'insetti, hè necessaria una strategia alternativa, à bassu costu è rispettosa di l'ambiente per cuntrullà l'infezzione da PWN in i pini. Stu studiu riporta ancu u mecanismu per u quale u 5-iodoindolu uccide i nematodi di u pinu è chì u 5-iodoindolu hà una bassa tossicità per e cellule vegetali, ciò chì apre bone prospettive per a so futura applicazione cummerciale.
Tutti l'esperimenti sò stati appruvati da u Cumitatu Eticu di l'Università Yeungnam, Gyeongsan, Corea, è i metudi sò stati realizati in cunfurmità cù e linee guida di u Cumitatu Eticu di l'Università Yeungnam.
L'esperimenti d'incubazione di l'ova sò stati realizati aduprendu procedure stabilite43. Per valutà i tassi di schiusa (HR), i nematodi adulti di 1 ghjornu (circa 100 femine è 100 masci) sò stati trasferiti in piastre di Petri chì cuntenenu u fungu è lasciati cresce per 24 ore. L'ova sò state poi isolate è trattate cù 5-iodoindolu (0,05 mM è 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) cum'è una sospensione in acqua distillata sterile. Queste sospensioni (500 μl; circa 100 ova) sò state trasferite in i pozzi di una piastra di cultura tissutale à 24 pozzi è incubate à 22 °C. I conteggi L2 sò stati effettuati dopu à 24 ore d'incubazione, ma sò stati cunsiderati morti se e cellule ùn si sò micca mosse quandu sò state stimulate cù un filu di platinu finu. Questu esperimentu hè statu realizatu in duie tappe, ognuna cù sei ripetizioni. I dati di i dui esperimenti sò stati cumminati è presentati. A percentuale di HR hè calculata cum'è seguita:
A mortalità larvale hè stata valutata aduprendu prucedure sviluppate in precedenza. L'ova di nematodi sò state raccolte è l'embrioni sò stati sincronizati per schiusa in acqua distillata sterile per generà larve di stadiu L2. E larve sincronizate (circa 500 nematodi) sò state trattate cù 5-iodoindolu (0,05 mM è 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) è allevate nantu à piastre Petri di B. cinerea. Dopu à 48 ore d'incubazione à 22 °C, i nematodi sò stati raccolti in acqua distillata sterile è esaminati per a presenza di i stadi L2, L3 è L4. A presenza di i stadi L3 è L4 indicava a trasfurmazione larvale, mentre chì a presenza di u stadiu L2 ùn indicava alcuna trasfurmazione. L'imaghjini sò state acquistate aduprendu u Sistema di Imaging Cellulare Digitale iRiS™. Questu esperimentu hè statu realizatu in duie fasi, ognuna cù sei ripetizioni. I dati di i dui esperimenti sò stati cumminati è presentati.
A tossicità di u 5-iodoindolu è di l'avermectina per i graneddi hè stata valutata aduprendu testi di germinazione nantu à piastre d'agar Murashige è Skoog.62 I graneddi di B. oleracea è R. raphanistrum sò stati prima immersi in acqua distillata sterile per un ghjornu, lavati cù 1 ml d'etanolu 100%, sterilizzati cù 1 ml di candeggina cummerciale 50% (3% ipocloritu di sodiu) per 15 minuti, è lavati cinque volte cù 1 ml d'acqua sterile. I graneddi sterilizzati sò stati poi pressati nantu à piastre d'agar di germinazione chì cuntenenu 0,86 g/l (0,2X) di mezu Murashige è Skoog è 0,7% d'agar batteriologicu cù o senza 5-iodoindolu o avermectina. I piastre sò stati poi incubati à 22 °C, è l'imagine sò state scattate dopu à 3 ghjorni d'incubazione. Questu esperimentu hè statu realizatu in duie tappe, ognuna di e quali avia sei ripetizioni.
Data di publicazione: 26 di ferraghju 2025