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Evaluazione di iodu è avermectin cum'è induttori di a malatia di nematodi di u pinu

U nematodu di u pinu hè un endoparasite migratoriu di quarantena cunnisciutu per causà perdite ecunomiche severi in l'ecosistema di a foresta di pinu. U presente studiu analizà l'attività nematicida di indoli alogenati contr'à i nematodi di pinu è u so mecanismu d'azzione. L'attività nematicidi di 5-iodoindole è avermectin (cuntrollu pusitivu) contr'à i nematodi di pinu eranu simili è altu à bassu concentrazioni (10 μg / mL). 5-iodoindole riduce a fecundità, l'attività riproduttiva, a mortalità embrionale è larvale, è u cumpurtamentu locomotore. L'interazzione moleculare di ligandi cù i receptori di u canali di cloruru di glutamate specifichi di l'invertebrati sustene a nuzione chì 5-iodoindole, cum'è avermectin, si lega strettamente à u situ attivu di u receptore. 5-Iodoindole hà ancu induciutu diverse deformazioni fenotipiche in i nematodi, cumpresi collapse / shrinkage di l'organi anormali è vacuolizazione aumentata. Questi risultati suggerenu chì i vacuoli ponu ghjucà un rolu in a morte mediata da a metilazione di nematodi. Impurtante, 5-iodoindole ùn era micca tossicu per e duie spezie vegetali (col è ravane). Cusì, stu studiu dimostra chì l'applicazione di iodoindole in cundizioni ambientali pò cuntrullà a ferita di u pinu.
U nematodu di u pinu (Bursaphelenchus xylophilus) appartene à i nematodi di u pinu (PWN), nematodi endoparassiti migratori cunnisciuti per causà danni ecologichi severi à l'ecosistema di u pinu1. A malatia di u pinu (PWD) causata da u nematodu di u pinu hè diventatu un prublema seriu in parechji cuntinenti, cumpresi l'Asia è l'Europa, è in l'America di u Nordu, u nematodu distrugge e spezie di pinu introduttu1,2. A decadenza di u pinu hè un prublema ecunomica maiò, è a pruspettiva di a so diffusione glubale hè preoccupante3. Les espèces de pins suivantes sont les plus souvent attaquées par le nématode : Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii et Pinus radiata4. U nematodu di u pinu hè una malatia seria chì pò tumbà i pini in settimane o mesi di infezzione. Inoltre, l'epidemie di nematodi di pinu sò cumuni in una varietà di ecosistemi, cusì e catene d'infezzione persistenti sò state stabilite1.
Bursaphelenchus xylophilus hè un nematode parassitariu vegetale di quarantena chì appartene à a superfamiglia Aphelenchoidea è clade 102.5. U nematodu si alimenta di fungi è si riproduce in i tessuti di lignu di l'arbureti di pinu, sviluppendu in quattru stadi larvali diffirenti: L1, L2, L3, L4 è un individuu adultu1,6. In cundizzioni di scarsità di l'alimentariu, u nematodu di pinu passa in un stadiu larvali specializatu - dauer, chì parasita u so vettore - u scarabeu di u pinu (Monochamus alternatus) è hè trasferitu à i pini sani. In l'ospiti sani, i nematodi migranu rapidamente à traversu i tessuti vegetali è si alimentanu di e cellule parenchymatous, chì porta à una quantità di reazzioni d'ipersensibilità, marchja di pinu è morte in un annu dopu l'infezzione1,7,8.
U cuntrollu biologicu di i nematodi di u pinu hè statu longu un sfida, cù misure di quarantena chì datanu di u XXu seculu. E strategie attuali per u cuntrollu di i nematodi di u pinu implicanu principalmente trattamenti chimichi, cumprese a fumigazione di legnu è l'implantazione di nematicidi in tronchi d'arburu. I nematicidi più cumunimenti usati sò l'avermectin è l'avermectin benzoate, chì appartenenu à a famiglia di l'avermectin. Sti chimichi caru sò assai efficaci contr'à parechje spezie di nematodi è sò cunsiderate sicuri per l'ambiente9. Tuttavia, l'usu ripetutu di questi nematicidi hè previstu di creà una pressione di selezzione chì quasi certamente porta à l'emergenza di nematodi di pinu resistenti, cum'è hè statu dimustratu per parechji pesti d'insetti, cum'è Leptinotarsa ​​​​decemlineata, Plutella xylostella è i nematodi Trichostrongylus colubriformis è Ostertagia, chì anu sviluppatu gradualmente resistenza à circumcincta,12,1211121. Per quessa, i mudelli di resistenza anu da esse studiatu regularmente è i nematicidi schermati continuamente per truvà misure alternative, efficaci è ecologiche per cuntrullà PVD. In l'ultimi decennii, parechji autori anu prupostu l'usu di l'estratti vegetali, olii essenziali è volatili cum'è agenti di cuntrollu di nematodi13,14,15,16.
Avemu recentemente dimustratu l'attività nematicida di l'indole, una molécula di signalazione intercellulare è interkingdom, in Caenorhabditis elegans 17 . Indole hè un signalu intracellulare generalizatu in l'ecologia microbiana, cuntrullendu numerosi funzioni chì affettanu a fisiologia microbica, a furmazione di spore, a stabilità di plasmidi, a resistenza à a droga, a furmazione di biofilm è a virulenza 18, 19. L'attività di l'indole è i so derivati ​​contru à altri nematodi patogeni ùn hè micca studiatu. In questu studiu, avemu investigatu l'attività nematicida di 34 indoli contr'à i nematodi di pinu è elucidatu u mecanismu d'azzione di u 5-iodoindole più putente utilizendu microscopia, fotografia time-lapse è esperimenti di docking moleculare, è hà valutatu i so effetti tossichi nantu à e piante utilizendu un test di germinazione di sementi.
Alte concentrazioni (> 1.0 mM) di indole sò stati rappurtati prima di avè un effettu nematicidale nantu à i nematodi17. Dopu à u trattamentu di B. xylophilus (stadi di vita misti) cù indole o 33 derivati ​​indole differenti à 1 mM, a mortalità di B. xylophilus hè stata misurata cuntendu nematodi vivi è morti in i gruppi di cuntrollu è trattati. Cinque indoli anu mostratu una attività nematicida significativa; a survival of the untreated control group was 95 ± 7% after 24 h. Di i 34 indoli testati, 5-iodoindole è 4-fluoroindole à 1 mM anu causatu 100% di mortalità, mentri 5,6-difluoroindigo, methylindole-7-carboxylate è 7-iodoindole causavanu circa 50% di mortalità (Table 1).
Effettu di 5-iodoindole nantu à a furmazione di vacuole è u metabolismu di u nematodu di u pinu. (A) Effettu di avermectin è 5-iodoindole nantu à nematodi maschi adulti, (B) uova di nematodi in fase L1 è (C) metabolismu di B. xylophilus, (i) vacuoli ùn sò micca stati osservati à 0 h, u trattamentu hà risultatu in (ii) vacuoli, (iii) accumulazione di vacuoli multipli, (iv) fusioni di vacuoli, (iv) vacuoles well (vi) formazione di vacuoli giganti. E frecce rosse indicanu gonfiore di vacuoli, frecce blu indicanu fusione di vacuoli è frecce nere indicanu vacuoli giganti. Scala bar = 50 μm.
Inoltre, stu studiu hà ancu descrittu u prucessu sequenziale di a morte indotta da metanu in nematodi di pinu (Figura 4C). A morte metanogenica hè un tipu di morte cellulare non apoptotica assuciata à l'accumulazione di vacuoli citoplasmatici prominenti27. I difetti morfologichi osservati in i nematodi di pinu parenu esse strettamente ligati à u mecanismu di a morte indotta da metanu. L'esame microscòpicu à i tempi diffirenti dimustrava chì i vacuoli giganti sò stati furmati dopu à 20 h di esposizione à 5-iodoindole (0,1 mM). I vacuoli microscòpichi sò stati osservati dopu à 8 h di trattamentu, è u so numeru hà aumentatu dopu à 12 h. Parechji grandi vacuoli sò stati osservati dopu à 14 h. Diversi vacuoli fusi sò chjaramente visibili dopu à 12-16 h di trattamentu, chì indicanu chì a fusione di vacuole hè a basa di u mecanismu di morte metanogenicu. Dopu à 20 ore, parechji vacuoli giganti sò stati truvati in tuttu u vermu. Queste osservazioni rapprisentanu u primu rapportu di metuosi in C. elegans.
In i vermi trattati cù 5-iodoindole, l'agregazione di vacuole è a rupture sò ancu osservati (Fig. 5), cum'è pruvucatu da a curvatura di vermi è a liberazione di vacuole in l'ambiente. A disrupzione di u vacuole hè stata osservata ancu in a membrana di l'ovu, chì hè normalment cunservata intacta da L2 durante l'incubazione (Figura supplementaria S2). Queste l'osservazioni sustene l'implicazione di l'accumulazione di fluidu è a fallimentu osmoregulatoriu, è ancu a ferita di cellula reversibile (RCI), in u prucessu di furmazione di vacuole è suppurazione (Fig. 5).
Ipotisendu u rolu di iodu in a furmazione di vacuole osservatu, avemu investigatu l'attività nematicida di ioduru di sodiu (NaI) è ioduru di potassiu (KI). In ogni casu, à e cuncentrazioni (0,1, 0,5 o 1 mM), ùn anu micca affettatu nè a sopravvivenza di nematodi nè a furmazione di vacuole (Figura Supplementaria S5), anche 1 mM KI hà avutu un ligeru effettu nematicidale. Per d 'altra banda, 7-iodoindole (1 o 2 mM), cum'è 5-iodoindole, induceva vacuoli multipli è deformazioni strutturali (Figura Supplementaria S6). I dui iodoindoli mostravanu caratteristiche fenotipiche simili in i nematodi di u pinu, mentri NaI è KI ùn anu micca. Curiosamente, l'indole ùn hà micca induce a furmazione di vacuole in B. xylophilus à i cuncentrazioni pruvati (dati micca mostrati). Cusì, i risultati cunfirmatu chì u cumplessu indole-iodine hè rispunsevule per a vacuolizazione è u metabolismu di B. xylophilus.
Trà l'indoli pruvati per l'attività nematicida, 5-iodoindole hà avutu u più altu indice di slip di -5.89 kcal / mol, seguita da 7-iodoindole (-4.48 kcal / mol), 4-fluoroindole (-4.33) è indole (-4.03) (Figura 6). U forte ligame di l'idrogenu di a spina dorsale di 5-iodoindole à a leucina 218 stabilizza u so ligame, mentre chì tutti l'altri derivati ​​di l'indole si liganu à a serina 260 per via di ligami d'idrogenu di a catena laterale. Frà l'altri iodoindoles modellati, 2-iodoindole hà un valore di ubligatoriu di -5.248 kcal / mol, chì hè duvuta à u so ligame principale di l'idrogenu cù leucine 218. Altri ligami cunnisciuti include 3-iodoindole (-4.3 kcal/mol), 4-iodoindole (-4.0 kcal/moli), è 6 kcal-/moli. (Figura supplementaria S8). A maiò parte di l'indoli alogenati è l'indole stessu, cù l'eccezzioni di 5-iodoindole è 2-iodoindole, formanu un ligame cù a serina 260. U fattu chì u ligame di l'idrogenu cù a leucina 218 hè indicativu di u ligame efficace di u receptore-ligandu, cum'è osservatu per l'ivermectin (Figura Supplementaria S7-2-Iodoi, 5-2-iodoindoi) ivermectin, ligà strettu à u situ attivu di u receptore GluCL via leucine 218 (Fig. 6 è Supplementary Fig. S8). Avemu prupostu chì sta ligame hè necessariu per mantene a struttura di pori aperti di u cumplessu GluCL è chì strettu à u situ attivu di u receptore GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin è ivermectin mantene cusì u canali ionicu apertu è permettenu l'assunzione di fluidu.
Docking moleculare di l'indolu è l'indole alogenatu à GluCL. Orientazioni di ubligatoriu di (A) indole, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, è (D) ligandi 5-iodoindole à u situ attivu di GluCL. A proteina hè rapprisintata da una cinta, è i ligami di l'idrogenu di a spina sò mostrati cum'è linee punteggiate gialli. (A′), (B′), (C′) è (D′) mostranu l'interazzione di i ligandi currispondenti cù i residui di aminoacidi circundanti, è i ligami d'idrogenu di a catena laterale sò indicati da frecce punteggiate rosa.
L'esperimenti sò stati realizati per evaluà l'effettu tossicu di 5-iodoindole nantu à a germinazione di colti è ravane. 5-iodoindole (0,05 o 0,1 mM) o avermectin (10 μg/mL) anu avutu pocu o nuddu effettu nantu à a germinazione iniziale è l'emergenza di plantule (Figura 7). Inoltre, nisuna differenza significativa hè stata truvata trà a rata di germinazione di cuntrolli senza trattamentu è e sementi trattati cù 5-iodoindole o avermectin. L'effettu nantu à l'allungamentu di u taproot è u nùmeru di razzi laterali formati era insignificante, anche 1 mM (10 volte a so cuncentrazione attiva) di 5-iodoindole hà ritardatu pocu u sviluppu di e razzi laterali. Questi risultati indicanu chì 5-iodoindole ùn hè micca tossicu per e cellule vegetali è ùn interferiscenu micca cù i prucessi di sviluppu di a pianta à e cuncentrazioni studiate.
Effettu di 5-iodoindole nantu à a germinazione di sementi. Germination, sproting and side rooting of B. oleracea è R. raphanistrum seeds on Murashige and Skoog agar medium with or without avermectin or 5-iodoindole. A germinazione hè stata registrata dopu à 3 ghjorni di incubazione à 22 ° C.
Stu studiu riporta parechji casi di morte di nematodi da indoli. Impurtante, questu hè u primu rapportu di iodoindole induce a metilazione (un prucessu causatu da l'accumulazione di picculi vacuoli chì si uniscenu gradualmente in vacuoli giganti, eventualmente purtendu à a rottura di a membrana è a morte) in aghi di pinu, cù iodoindole chì mostra proprietà nematicidi significativi simili à quelli di l'avermectin nematicide cummerciale.
L'indoli sò stati precedentemente riportati chì esercitanu funzioni di segnalazione multiple in procarioti è eucarioti, cumprese l'inibizione / a furmazione di biofilm, a sopravvivenza bacteriana è a patogenicità19,32,33,34. Ricertamenti, i putenziali effetti terapeutichi di l'indoli alogenati, l'alkaloidi indole è i derivati ​​semisintetici di l'indole anu attrattu un vastu interessu di ricerca35,36,37. Per esempiu, l'indoli alogenati sò stati dimustrati per tumbà e cellule persistenti di Escherichia coli è Staphylococcus aureus37. Inoltre, hè d'interessu scientificu per studià l'efficacità di l'indoli alogenati contr'à altre spezie, generi è regni, è stu studiu hè un passu versu stu scopu.
Quì, prupunemu un mecanismu per a letalità indotta da 5-iodoindole in C. elegans basatu nantu à a ferita cellulare reversibile (RCI) è a metilazione (Figures 4C è 5). I cambiamenti edematosi, cum'è a puffiness è a degenerazione vacuolar sò indicatori di RCI è di metilazione, manifestati cum'è vacuoli giganti in u citoplasma48,49. RCI interferisce cù a produzzione di energia riducendu a pruduzzione di ATP, causendu fallimentu di a pompa ATPase, o disrupting membrane cells è pruvucannu un rapidu afflussu di Na +, Ca2 +, è acqua50,51,52. I vacuoli intracitoplasmatici nascenu in e cellule animali cum'è u risultatu di l'accumulazione di fluidu in u citoplasma per via di l'afflussu di Ca2+ è acqua53. Curiosamente, stu mecanismu di dannu cellu hè reversibile se u dannu hè tempuranee è e cellule cumincianu à pruduce ATP per un certu periudu di tempu, ma se u dannu persiste o s'aggrava, i celluli die.54 I nostri osservazioni mostranu chì i nematodi trattati cù 5-iodoindole ùn sò micca capaci di restaurà a biosintesi normale dopu l'esposizione à e cundizioni di stress.
U fenotipu di metilazione induvatu da 5-iodoindole in B. xylophilus pò esse dovutu à a prisenza di iodu è a so distribuzione moleculare, postu chì 7-iodoindole hà avutu un effettu inhibitore menu in B. xylophilus cà 5-iodoindole (Table 1 and Supplementary Figure S6). Questi risultati sò parzialmente cunsistenti cù i studii di Maltese et al. (2014), chì hà infurmatu chì a traslocazione di a molecula di nitrogenu piridil in l'indole da a para-à a meta-posizione abolì a vacuolizazione, l'inibizione di a crescita è a citotossicità in e cellule U251, suggerenu chì l'interazzione di a molécula cù un situ attivu specificu in a proteina hè critica27,44,45. L'interazzione trà i indoli indoli o alogenati è i receptori GluCL osservati in stu studiu sustenenu ancu sta nozione, postu chì 5- è 2-iodoindole sò stati trovati per ligà à i receptori GluCL più forte cà l'altri indoli esaminati (Figura 6 è Supplementary Figure S8). L'iodu à a seconda o quinta pusizioni di l'indole hè stata trovata à ligà à a leucina 218 di u receptore GluCL via ligami di l'idrogenu di a spina dorsale, mentri àutri indoli halogenati è l'indole stessu formanu ligami d'idrogenu di catena laterale debule cù a serina 260 (Figura 6). Per quessa, speculemu chì a localizazione di l'alogenu ghjoca un rolu impurtante in l'induzione di a degenerazione vacuolare, mentre chì a legame strettu di 5-iodoindole mantene u canale ionicu aperto, permettendu cusì un flussu rapidu di fluidu è a rupture di vacuole. Tuttavia, u mecanismu detallatu di l'azzione di 5-iodoindole resta per esse determinatu.
Prima di l'applicazione pratica di 5-iodoindole, u so effettu tossicu nantu à e piante deve esse analizatu. I nostri esperimenti di germinazione di sementi dimustranu chì 5-iodoindole ùn hà micca effettu negativu nantu à a germinazione di sementi o prucessi di sviluppu sussegwente à e cuncentrazioni studiate (Figura 7). Cusì, stu studiu furnisce una basa per l'usu di 5-iodoindole in l'ambiente ecologicu per cuntrullà a dannità di i nematodi di pinu à i pini.
I rapporti precedenti anu dimustratu chì a terapia basata in indole rapprisenta un approcciu potenziale per affruntà u prublema di a resistenza à l'antibiotici è a progressione di u cancer55. Inoltre, l'indoli pussede attività antibacteriale, anticancer, antioxidante, antiinflamatorii, antidiabetiche, antivirali, antiproliferative è antituberculose è ponu serve com'è una basa promettente per u sviluppu di droghe56,57. Stu studiu suggerisce per a prima volta l'usu potenziale di iodu cum'è agenti antiparasitari è antihelmintichi.
Avermectin hè statu scupertu trè decennii fà è hà guadagnatu u Premiu Nobel in u 2015, è u so usu cum'è antihelminticu hè sempre attivu. In ogni casu, per via di u rapidu sviluppu di a resistenza à l'avermectini in i nematodi è i pesti d'insetti, hè necessariu una strategia alternativa, low-cost è ecologica per cuntrullà l'infezzione PWN in i pini. Stu studiu informa ancu u mecanismu da quale 5-iodoindole uccide i nematodi di pinu è chì 5-iodoindole hà una toxicità bassa per e cellule vegetali, chì apre boni prospettivi per a so futura applicazione cummerciale.
Tutti l'esperimenti sò stati appruvati da u Cumitatu Eticu di l'Università Yeungnam, Gyeongsan, Corea, è i metudi sò stati realizati in cunfurmità cù e linee di u Cumitatu Eticu di l'Università Yeungnam.
L'esperimenti d'incubazione di l'ova sò stati realizati cù e prucedure stabilite43. Per evaluà i tassi d'incubazione (HR), i nematodi adulti di 1 ghjornu (circa 100 femine è 100 masci) sò stati trasferiti à i platti Petri chì cuntenenu u fungus è permessi di cultivà per 24 h. Les œufs ont ensuite été isolés et traités avec du 5-iodoindole (0,05 mM et 0,1 mM) ou de l'avermectine (10 μg/ml) en suspension dans de l'eau distillée stérile. Queste sospensioni (500 μl; circa 100 ova) sò stati trasferiti à i pozzi di una piastra di cultura tissutale di 24 pozzi è incubati à 22 ° C. I cunti L2 sò stati fatti dopu à 24 h d'incubazione, ma sò stati cunsiderati morti si e cellule ùn si movevanu micca quandu stimulate cù un filu di platinu finu. Stu esperimentu hè statu fattu in dui tappe, ognunu cù sei ripetizioni. I dati da i dui esperimenti sò stati cumminati è presentati. U percentuale di HR hè calculatu cum'è seguente:
A mortalità di larva hè stata valutata cù e prucedure sviluppate prima. L'ova di nematodi sò stati raccolti è l'embrioni sò stati sincronizati da l'incubazione in acqua distillata sterile per generà larva di stadiu L2. I larvati sincronizati (circa 500 nematodi) sò stati trattati cù 5-iodoindole (0,05 mM è 0,1 mM) o avermectin (10 μg / ml) è sbulicati nantu à i platti B. cinerea Petri. Dopu à 48 h d'incubazione à 22 ° C, i nematodi sò stati cullati in acqua distillata sterile è esaminati per a presenza di stadi L2, L3 è L4. A prisenza di stadi L3 è L4 indicava trasfurmazioni larvali, mentri a prisenza di u stadiu L2 ùn indicava micca trasfurmazioni. L'imaghjini sò stati acquistati cù u Sistema di Imaging Cellulare Digitale iRiS ™. Stu esperimentu hè statu fattu in dui tappe, ognunu cù sei ripetizioni. I dati da i dui esperimenti sò stati cumminati è presentati.
A toxicità di 5-iodoindole è avermectin à e sementi hè stata valutata cù e teste di germinazione nantu à i platti d'agar Murashige è Skoog. 62 B. oleracea è R. raphanistrum seeds sò stati prima imbevuti in acqua distillata sterile per un ghjornu, lavatu cù 1 ml 100% etanol 100% cumerciale sodium 50%, sterilized 3% hypochlorite) per 15 min, è lavatu cinque volte cù 1 ml d'acqua sterile. I graneddi sterilizzati sò stati pressati nantu à i platti di agar di germinazione chì cuntenenu 0,86 g / l (0,2X) Murashige è Skoog medium è 0,7% agar bacteriologicu cù o senza 5-iodoindole o avermectin. I platti sò stati incubati à 22 ° C, è l'imaghjini sò stati pigliati dopu à 3 ghjorni di incubazione. Stu esperimentu hè statu realizatu in dui tappe, ognunu di i quali hà avutu sei ripetizioni.


Tempu di Postu: Feb-26-2025