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A scuperta è l'usu beneficu di i prudutti naturali ponu aiutà à migliurà a vita umana. I prudutti chimichi inibitori di a crescita di e piante sò largamente usati cum'è erbicidi per cuntrullà e erbe infestanti. A causa di a necessità di utilizà diversi tipi d'erbicidi, ci hè bisognu d'identificà cumposti cù novi meccanismi d'azione. In questu studiu, avemu scupertu un novu cumpostu N-alcossipirolu, a cumamonamide, da Streptomyces werraensis MK493-CF1 è avemu stabilitu u prucessu cumpletu di sintesi. Attraversu testi d'attività biologica, avemu scupertu chì l'acidu urs-monoamicu hè un intermediu sinteticu di l'urs-monoamide è un putenziale...inhibitore di a crescita di e pianteInoltre, avemu sviluppatu diversi derivati di l'acidu urbenonicu, cumpresu u derivatu urbenilossidu (UDA), chì hà una alta attività erbicida senza influenzà negativamente a crescita di e cellule HeLa. Avemu ancu trovu chì i derivati di l'acidu urmotonicu perturbanu i microtubuli di e piante; inoltre, KAND affetta i filamenti di actina è induce a morte cellulare; Quessi effetti multiformi differiscenu da quelli di l'inibitori di microtubuli cunnisciuti è suggerenu un novu mecanismu d'azione per l'acidu ursonicu, chì rapprisenta un vantaghju impurtante in u sviluppu di novi erbicidi.
A scuperta è l'applicazione pratica di prudutti naturali benefichi è di i so derivati hè un mezzu per migliurà a qualità di a vita umana. I metaboliti secundarii prudutti da microrganismi, piante è insetti anu purtatu à grandi progressi in medicina è agricultura. Parechji antibiotici è medicinali antileucemici sò stati sviluppati da prudutti naturali. Inoltre, vari tipi dipesticidi, i fungicidi è l'erbicidi sò estratti da questi prudutti naturali per l'usu in agricultura. In particulare, l'erbicidi per u cuntrollu di e erbe infestanti sò strumenti impurtanti per aumentà i rendimenti di e culture in l'agricultura muderna, è diversi tipi di cumposti sò digià aduprati cummercialmente. Parechji prucessi cellulari in e piante, cum'è a fotosintesi, u metabolismu di l'aminoacidi, a sintesi di a parete cellulare, a regulazione di a mitosi, a segnalazione di fitormoni o a sintesi di proteine, sò cunsiderati obiettivi tipici di l'erbicidi. I cumposti chì inibiscenu a funzione di i microtubuli sò una classa cumuna di erbicidi chì influenzanu a crescita di e piante affettendu a regulazione mitotica2.
I microtubuli sò cumpunenti di u citoscheletru è sò largamente cunservati in e cellule eucariote. L'eterodimeru di tubulina hè custituitu da α-tubulina è β-tubulina chì formanu protofilamenti di microtubuli lineari, cù 13 protofilamenti chì formanu una struttura cilindrica. I microtubuli ghjucanu parechji roli in e cellule vegetali, cumprese a determinazione di a forma cellulare, a divisione cellulare è u trasportu intracellulare3,4. E cellule vegetali cuntenenu microtubuli sottu à a membrana plasmatica interfasica, è si pensa chì questi cusì detti microtubuli corticali cuntrolanu l'urganizazione di e microfibrille di cellulosa attraversu a regulazione di i cumplessu di sintasi di cellulosa4,5. I microtubuli corticali di e cellule epidermiche radicali, presenti in a zona di rapidu allungamentu di a punta di a radice, sò situati lateralmente, è e microfibre di cellulosa seguitanu questi microtubuli è limitanu a direzzione di l'espansione cellulare, prumovendu cusì l'allungamentu cellulare anisotropicu. Dunque, a funzione di i microtubuli hè strettamente ligata à a morfologia di a pianta. E sustituzioni di aminoacidi in i geni chì codificanu a tubulina causanu una distorsione di l'arrays di microtubuli corticali è una crescita à manca o à diritta in Arabidopsis 6,7. In listessu modu, e mutazioni in e proteine assuciate à i microtubuli chì regulanu a dinamica di i microtubuli ponu ancu purtà à una crescita distorta di e radiche8,9,10,11,12,13. Inoltre, u trattamentu cù erbicidi chì disturbanu i microtubuli cum'è a disopiramide, cunnisciuta ancu cum'è pretilaclor, provoca ancu una crescita di e radiche oblique à manca14. Quessi dati indicanu chì una regulazione precisa di a funzione di i microtubuli hè critica per determinà a direzzione di a crescita di e piante.
Diversi tipi d'inibitori di microtubuli sò stati scuperti, è sti medicamenti anu fattu cuntribuzioni significative à a ricerca citoscheletrica, è ancu à l'agricultura è a medicina2. In particulare, l'oryzalin, i cumposti di dinitroanilina, a disopiramide, i cumposti ligati à a benzamide, è i so analoghi ponu inibisce a funzione di i microtubuli è cusì inibisce a crescita di e piante. Dunque, sò largamente usati cum'è erbicidi. Tuttavia, postu chì i microtubuli sò un cumpunente impurtante di e cellule vegetali è animali, a maiò parte di l'inibitori di microtubuli sò citotossici per i dui tipi di cellule. Dunque, malgradu a so utilità ricunnisciuta cum'è erbicidi, un numeru limitatu di agenti antimicrotubuli sò usati per scopi pratichi.
Streptomyces hè un generu di a famiglia Streptomyces, chì include batteri aerobi, gram-pusitivi, filamentosi è hè largamente cunnisciutu per a so capacità di pruduce una vasta gamma di metaboliti secundarii. Dunque, hè cunsideratu una di e fonti più impurtanti di novi prudutti naturali biologicamente attivi. In u studiu attuale, avemu scupertu un novu cumpostu chjamatu cumamonamide, chì hè statu isolatu da Streptomyces werraensis MK493-CF1 è S. werraensis ISP 5486. Usendu l'analisi spettrale è l'analisi spettrale cumpleta, a struttura di a cumamonamide hè stata caratterizata è u so scheletru unicu di N-alcossipirolu hè statu determinatu. sintesi. L'acidu ursmonicu, un intermediu sinteticu di l'ursmonoamide è i so derivati, hè statu trovu per inibisce a crescita è a germinazione di a pianta mudellu pupulare Arabidopsis thaliana. In un studiu di relazione struttura-attività, avemu trovu chì un cumpostu cù C9 mudificatu in acidu ursonicu, chjamatu derivatu nonilossicu di l'acidu ursonicu (KAND), aumenta significativamente l'effettu inhibitoriu nantu à a crescita è a germinazione. In particulare, l'inibitore di a crescita di e piante appena scupertu hà ancu influenzatu a crescita di u tabaccu è di l'epatica è ùn era micca citotossicu per i batteri o e cellule HeLa. Inoltre, certi derivati di l'acidu urmotonicu inducenu un fenotipu radicale distorto, ciò chì implica chì questi derivati affettanu direttamente o indirettamente i microtubuli. In cunfurmità cù sta idea, e nostre osservazioni di microtubuli marcati sia immunoistochimicamente sia cù proteine fluorescenti indicanu chì u trattamentu KAND depolimerizza i microtubuli. Inoltre, u trattamentu cù derivati di l'acidu kumamotonicu hà disturbatu i microfilamenti di actina. Cusì, avemu scupertu un novu inhibitore di a crescita di e piante chì u so unicu mecanismu d'azione implica a distruzzione di u citoscheletru.
A ceppa MK493-CF1 hè stata isolata da u terrenu in Shinagawa-ku, Tokyo. A ceppa MK493-CF1 hà furmatu un miceliu stromale ben ramificatu. A sequenza parziale di u genu RNA ribosomiale 16S (1422 bp) hè stata determinata. Sta ceppa hè assai simile à S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: ceppa tipica, 99,93%). Basatu annantu à stu risultatu, hè statu determinatu chì sta ceppa era strettamente ligata à a ceppa tipu di S. werraensis. Dunque, avemu chjamatu pruvisoriamente sta ceppa S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T produce ancu i stessi cumposti bioattivi. Siccomu ci era poca ricerca iniziale per ottene prudutti naturali da stu microorganismu, sò state realizate ulteriori ricerche chimiche. Dopu a cultura di S. werraensis MK493-CF1 nant'à un mezu d'orzu per fermentazione à statu solidu à 30°C per 14 ghjorni, u mezu hè statu estrattu cù 50% EtOH. 60 ml di campione sò stati secchi per ottene 59,5 mg d'estrattu crudu. L'estrattu crudu hè statu sottumessu à HPLC in fase inversa per dà N-metossi-1H-pirrolu-2-carbossammide (1, chjamata coumamonamide, 36,0 mg). A quantità tutale di 1 hè circa u 60% di l'estrattu crudu. Dunque, avemu decisu di studià in dettagliu e proprietà di kumamotoamide 1.
A Coumamonamide 1 hè una polvere amorfa bianca è a spettrometria di massa à alta risoluzione (HRESIMS) cunfirma C6H8N2O2 (Fig. 1). U frammentu di pirrolu sustituitu cù C2 di stu cumpostu hè carattarizatu da δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH in u spettru NMR 1H: 4,5 Hz, H-5) è δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), è u spettru NMR 13C mostra a presenza di quattru atomi di carboniu sp2. A presenza di un gruppu amide in a pusizione C2 hè stata valutata da a currelazione HMBC da u protone C-3 à u carbone carbonile amide à δC 161,1. Inoltre, i picchi NMR 1 H è 13 C à δH 4.10 (3H, S) è δC 68.3 indicanu a presenza di gruppi N-metossi in a molecule. Ancu s'è a pusizione curretta di u gruppu metossi ùn era ancu stata determinata aduprendu l'analisi spettroscopica cum'è a spettroscopia di differenza mejorata è l'abbreviazione nucleare Overhauser (NOEDF), N-metossi-1H-pirrolu-2-carbossammide hè diventatu u primu compostu candidatu.
Per determinà a struttura curretta di 1, hè stata realizata una sintesi tutale (Fig. 2a). U trattamentu di a 2-aminopiridina 2 dispunibule cummercialmente cù m-CPBA hà risultatu in u currispundente N-ossidu 3 in rendimentu quantitativu. Dopu a 2-aminoazidazione di 2, a reazione di ciclocondensazione descritta da Abramovich hè stata realizata in benzene à 90 ° C per ottene u desideratu 1-idrossi-1H-pirrole-2-carbonitrile 5 in grammi. Velocità 60% (duie tappe). 15,16. A metilazione è l'idrolisi di 4 anu poi datu l'acidu 1-metossi-1H-pirrole-2-carbossilicu (chjamatu "acidu cumotonicu", 6) in bonu rendimentu (70%, duie tappe). Infine, l'amidazione via l'intermediu di cloruru d'acidu 6 utilizendu ammonia acquosa hà datu Kumamoto amide 1 in un rendimentu di 98%. Tutti i dati spettrali di 1 sintetizatu eranu simili à 1 isolatu, dunque a struttura di 1 hè stata determinata;
Sintesi generale è analisi di l'attività biologica di l'urbenamide è di l'acidu urbenicu. (a) Sintesi tutale di l'amide di Kumamoto. (b) Piantine di Arabidopsis Columbia (Col) di tipu salvaticu di sette ghjorni sò state cultivate nantu à piastre Murashige è Skoog (MS) chì cuntenenu cumamonamide 6 o cumamonamide 1 à e concentrazioni indicate. Barra di scala = 1 cm.
Prima, avemu valutatu l'attività biologiche di l'urbenamide è di i so intermedi per a so capacità di modulà a crescita di e piante. Avemu aghjustatu diverse concentrazioni di ursmonamide 1 o acidu ursonicu 6 à u mediu MS agar è avemu cultivatu piantine di Arabidopsis thaliana nantu à questu mediu. Quessi testi anu dimustratu chì alte concentrazioni (500 μM) di 6 inibianu a crescita di e radiche (Fig. 2b). Dopu, avemu generatu diversi derivati sustituendu a pusizione N1 di 6 è avemu realizatu studii di relazione struttura-attività nantu à elli (u prucessu di sintesi analogica hè discrittu in l'Infurmazioni Supplementari (SI)). E piantine di Arabidopsis sò state cultivate nantu à un mediu chì cuntene 50 μM di derivati di l'acidu ursonicu, è a lunghezza di e radiche hè stata misurata, cum'è mostratu in l'imagine. Cum'è mostratu in e Figure 3a, b è S1, l'acidi cumamo anu diverse lunghezze di catene alcossiche lineari (9, 10, 11, 12 è 13) o grandi catene alcossiche (15, 16 è 17) in a pusizione N1. I derivati anu dimustratu una inibizione significativa di a crescita di e radiche. Inoltre, avemu trovu chì l'applicazione di 200 μM 10, 11, o 17 hà inibitu a germinazione (Fig. 3c è S2).
Studiu di a relazione struttura-attività di l'amide di Kumamoto è di i cumposti correlati. (a) Schema di struttura è sintesi di l'analoghi. (b) Quantificazione di a lunghezza di e radiche di e piantine di 7 ghjorni cultivate nantu à u mezu MS cù o senza derivati di cumamonamide 50 μM. L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05). n>18. I dati sò mostrati cum'è media ± SD. nt significa "micca testatu" perchè più di u 50% di e sementi ùn anu micca germinatu. (c) Quantificazione di u tassu di germinazione di e sementi trattate incubate per 7 ghjorni in mezu MS cù o senza 200 μM di cumamonamide è cumposti correlati. L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test chi-quadratu). n = 96.
Curiosamente, l'aghjunta di catene laterali alchiliche più lunghe di C9 hà riduttu l'attività inibitoria, ciò chì suggerisce chì i cumposti correlati à l'acidu kumamotoicu necessitanu catene laterali di una certa dimensione per mustrà a so attività biologica.
Siccomu l'analisi di a relazione struttura-attività hà dimustratu chì C9 hè statu mudificatu in acidu ursonicu è chì u derivatu nonilossicu di l'acidu ursonicu (in seguitu chjamatu KAND 11) era l'inibitore di a crescita di e piante u più efficace, avemu realizatu una caratterizazione più dettagliata di KAND 11. U trattamentu di Arabidopsis cù 50 μM di KAND 11 hà impeditu quasi cumpletamente a germinazione, mentre chì concentrazioni più basse (40, 30, 20, o 10 μM) di KAND 11 anu inibitu a crescita di e radiche in modu dose-dipendente (Fig. 4a, b). Per verificà se KAND 11 influenza a viabilità di u meristema radicale, avemu esaminatu i meristemi radicali culuriti cù ioduro di propidiu (PI) è misuratu a dimensione di l'area di u meristema. A dimensione di u meristemu di e piantine cultivate nantu à un mezu chì cuntene 25 μM di KAND-11 era 151,1 ± 32,5 μm, mentre chì a dimensione di u meristemu di e piantine cultivate nantu à un mezu di cuntrollu chì cuntene DMSO era 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), ciò chì indica chì KAND-11 restaura l'attività cellulare. sparghjendu. Meristemu radicale. In cunfurmità cù questu, u trattamentu KAND 11 hà riduttu a quantità di u signale di marcatore di divisione cellulare CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS in u meristemu radicale (Fig. 4e) 17. Quessi risultati indicanu chì KAND 11 inibisce a crescita di e radiche riducendu l'attività di proliferazione cellulare.
Analisi di l'effettu inibitoriu di i derivati di l'acidu urbenonicu (derivati urbenilossidi) nantu à a crescita. (a) Piantine di Col di tipu salvaticu di 7 ghjorni cultivate nantu à piastre MS cù e concentrazioni indicate di KAND 11. Barra di scala = 1 cm. (b) Quantificazione di a lunghezza di a radica. E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05). n>16. I dati sò mostrati cum'è media ± SD. (c) Microscopia cunfocale di radiche di Col di tipu salvaticu culurite cù ioduro di propidiu cultivate nantu à piastre MS cù o senza 25 μM KAND 11. E parentesi bianche indicanu u meristema radicale. Barra di scala = 100 µm. (d) Quantificazione di a dimensione di u meristema radicale (n = 10 à 11). E differenze statistiche sò state determinate aduprendu u t-test (p< 0,05). E barre rapprisentanu a dimensione media di u meristema. (e) Microscopia di cuntrastu d'interferenza differenziale (DIC) di un meristema radicale chì cuntene a custruzzione CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS culuritu è culuritu nantu à piantine di 5 ghjorni cultivate nantu à piastre MS cù o senza test KAND di 25 µM.
A fitotossicità di KAND 11 hè stata ulteriormente testata aduprendu un'altra pianta dicotiledone, u tabaccu (Nicotiana tabacum), è un impurtante urganisimu mudellu di pianta terrestre, l'epatica (Marchantia polymorpha). Cum'è in u casu di Arabidopsis, e piantine di tabaccu SR-1 cultivate nantu à un mezu chì cuntene 25 μM di KAND 11 anu pruduttu radiche più corte (Fig. 5a). Inoltre, 40 di 48 semi anu germinatu nantu à piastre chì cuntenenu 200 μM di KAND 11, mentre chì tutti i 48 semi anu germinatu nantu à mezi trattati fintamente, indicendu chì concentrazioni più elevate di KAND eranu significative (p< 0,05; test chi -quadratu) hà inibitu a germinazione di u tabaccu. (Fig. 5b). Inoltre, a cuncentrazione di KAND 11 chì hà inibitu a crescita batterica in l'epatica era simile à a cuncentrazione efficace in Arabidopsis (Fig. 5c). Questi risultati indicanu chì KAND 11 pò inibisce a crescita di una varietà di piante. Avemu dopu investigatu a pussibile citotossicità di i cumposti ligati à a monoamide di l'orsu in altri organismi, vale à dì e cellule HeLa umane è u ceppo di Escherichia coli DH5α, cum'è rappresentanti di cellule animali è batteriche superiori, rispettivamente. In una seria di saggi di proliferazione cellulare, avemu osservatu chì a cumamonamide 1, l'acidu cumamonamidicu 6 è KAND 11 ùn anu micca influenzatu a crescita di e cellule HeLa o E. coli à cuncentrazioni di 100 μM (Fig. 5d,e).
Inibizione di a crescita di KAND 11 in organismi non-Arabidopsis. (a) Piantine di tabacco SR-1 di tipu salvaticu di duie settimane sò state cultivate nantu à piastre MS posizionate verticalmente chì cuntenenu 25 μM di KAND 11. (b) Piantine di tabacco SR-1 di tipu salvaticu di duie settimane sò state cultivate nantu à piastre MS posizionate orizzontalmente chì cuntenenu 200 μM di KAND 11. (c) Germogli di epatica Tak-1 di tipu salvaticu di duie settimane cultivati nantu à piastre Gamborg B5 cù e concentrazioni indicate di KAND 11. E frecce rosse indicanu e spore chì anu cessatu di cresce in u periodu di incubazione di duie settimane. (d) Saggio di proliferazione cellulare di e cellule HeLa. U numeru di cellule vitali hè statu misuratu à intervalli di tempu fissi utilizendu un kit di conteggio cellulare 8 (Dojindo). Cum'è cuntrollu, e cellule HeLa sò state trattate cù 5 μg/ml di actinomicina D (Act D), chì inibisce a trascrizione di l'RNA polimerasi è provoca a morte cellulare. L'analisi sò state realizate in triplicatu. (e) Saggio di proliferazione cellulare di E. coli. A crescita di E. coli hè stata analizzata misurendu OD600. Cum'è cuntrollu, e cellule sò state trattate cù 50 μg/ml d'ampicillina (Amp), chì inibisce a sintesi di a parete cellulare batterica. L'analisi sò state realizate in triplicatu.
Per decifrà u mecanismu d'azione di a citotossicità causata da i cumposti ligati à l'uramide, avemu rianalizatu i derivati di l'acidu urbenicu cù effetti inhibitori moderati, cum'è mostratu in l'imagine. Cum'è mostratu in e Figure 2b, 6a, e piantine cultivate nantu à piastre d'agar chì cuntenenu alte concentrazioni (200 μM) d'acidu urmotonicu 6 anu pruduttu radiche più corte è curve à manca (θ = – 23,7 ± 6,1), mentre chì di e piantine cultivate nantu à u mezu di cuntrollu, e piantine anu pruduttu radiche quasi dritte (θ = – 3,8 ± 7,1). Sta crescita obliqua caratteristica hè cunnisciuta per esse u risultatu di a disfunzione di i microtubuli corticali14,18. In cunfurmità cù sta scuperta, i farmaci destabilizzanti i microtubuli, a disopiramide è l'oryzalin, anu induttu una inclinazione di e radiche simile in e nostre cundizioni di crescita (Fig. 2b, 6a). À u listessu tempu, avemu testatu i derivati di l'acidu urmotonicu è avemu sceltu parechji di elli chì, à certe concentrazioni, anu induttu a crescita di e radiche oblique. I cumposti 8, 9 è 15 anu cambiatu a direzzione di a crescita di e radiche à 75 μM, 50 μM è 40 μM, rispettivamente, ciò chì indica chì sti cumposti ponu destabilizzà efficacemente i microtubuli (Fig. 2b, 6a). Avemu ancu testatu u derivatu di l'acidu ursolico u più putente, KAND 11, à una cuncentrazione più bassa (15 µM) è avemu trovu chì l'applicazione di KAND 11 inibisce a crescita di e radiche è chì a direzzione di a crescita di e radiche era irregulare, ancu s'elli tendevanu à pende à manca (Figura C3). Siccome e concentrazioni più elevate di droghe destabilizzanti i microtubuli qualchì volta inibiscenu a crescita di e piante invece di causà l'inclinazione di e radiche, avemu successivamente valutatu a pussibilità chì KAND 11 affetti i microtubuli osservendu i microtubuli corticali in e cellule epidermiche di e radiche. L'immunoistochimica cù anticorpi anti-β-tubulina in e cellule epidermiche di e radiche di e piantine trattate cù 25 μM di KAND 11 hà mostratu a sparizione di quasi tutti i microtubuli corticali in e cellule epidermiche in a zona di allungamentu (Fig. 6b). Questi risultati indicanu chì l'acidu kumamotonicu è i so derivati agiscenu direttamente o indirettamente nantu à i microtubuli per disturballi è chì questi cumposti sò novi inibitori di microtubuli.
L'acidu ursonicu è i so derivati alteranu i microtubuli corticali in Arabidopsis thaliana. (a) Angulu d'inclinazione di a radica misuratu in presenza di vari derivati di l'acidu urmotonicu à e concentrazioni indicate. Sò stati ancu analizati l'effetti di dui cumposti cunnisciuti per inibisce i microtubuli: disopiramide è orizalina. L'insertu mostra u standard utilizatu per misurà l'angulu di crescita di a radica. L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05). n>19. Barra di scala = 1 cm. (b) Microtubuli corticali in cellule epidermiche in a zona di elongazione. I microtubuli in e radiche di Arabidopsis Col di tipu salvaticu cultivate nantu à piastre MS cù o senza 25 μM KAND 11 sò stati visualizati per culurazione immunoistochimica utilizendu anticorpi primari di β-tubulina è anticorpi secundarii cuniugati cù Alexa Fluor. Barra di scala = 10 µm. (c) Struttura mitotica di i microtubuli in u meristema radicale. I microtubuli sò stati visualizati utilizendu culurazione immunoistochimica. E strutture mitotiche, cumprese e zone di profase, i fusi è i fragmoplasti, sò state cuntate da immagini cunfocali. E frecce indicanu e strutture di microtubuli mitotici. L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05). n>9. Barra di scala = 50 µm.
Ancu s'è Ursa hà a capacità di disturbà a funzione di i microtubuli, si prevede chì u so mecanismu d'azione sia differente da l'agenti tipici di depolimerizazione di i microtubuli. Per esempiu, concentrazioni più elevate di agenti di depolimerizazione di i microtubuli cum'è a disopiramide è l'oryzalin inducenu l'espansione anisotropica di e cellule epidermiche, mentre chì KAND 11 ùn a face micca. Inoltre, a co-applicazione di KAND 11 è disopiramide hà risultatu in una risposta cumminata di crescita di e radiche indotta da a disopiramide è hè stata osservata l'inibizione di a crescita indotta da KAND 11 (Fig. S4). Avemu ancu analizatu a risposta di u mutante ipersensibile disopiramide 1-1 (phs1-1) à KAND 11. phs1-1 hà una mutazione puntuale di tubulina chinasi non canonica è produce radiche più corte quandu hè trattatu cù disopiramide9,20. E piantine mutanti phs1-1 cultivate nantu à un mezu d'agar chì cuntene KAND 11 avianu radiche più corte simili à quelle cultivate nantu à a disopiramide (fig. S5).
Inoltre, avemu osservatu strutture di microtubuli mitotici, cum'è zone di profase, fusi è fragmoplasti, in u meristema radicale di e piantine trattate cù KAND 11. In cunfurmità cù l'osservazioni per CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS, hè stata osservata una diminuzione significativa di u numeru di microtubuli mitotici (Fig. .6c).
Per caratterizà a citotossicità di KAND 11 à risoluzione subcellulare, avemu trattatu e cellule di sospensione di tabacco BY-2 cù KAND 11 è osservatu a so risposta. Avemu prima aghjuntu KAND 11 à e cellule BY-2 chì esprimenu TagRFP-TUA6, chì marca fluorescentemente i microtubuli, per valutà l'effettu di KAND 11 nantu à i microtubuli corticali. A densità di i microtubuli corticali hè stata valutata utilizendu l'analisi di l'immagine, chì hà quantificatu a percentuale di pixel citoscheletrici trà i pixel citoplasmatici. I risultati di u test anu dimustratu chì dopu u trattamentu cù 50 μM o 100 μM KAND 11 per 1 ora, a densità hè diminuita significativamente à 0,94 ± 0,74% o 0,23 ± 0,28%, rispettivamente, mentre chì a densità di e cellule trattate cù DMSO era di 1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Quessi risultati sò coerenti cù l'osservazione in Arabidopsis chì u trattamentu KAND 11 induce a depolimerizazione di i microtubuli corticali (Fig. 6b). Avemu ancu esaminatu a linea BY-2 cù filamenti d'actina marcati cù GFP-ABD dopu u trattamentu cù a stessa cuncentrazione di KAND 11 è avemu osservatu chì u trattamentu KAND 11 hà disturbatu i filamenti d'actina. U trattamentu cù 50 μM o 100 μM KAND 11 per 1 ora hà riduttu significativamente a densità di i filamenti d'actina à 1,20 ± 0,62% o 0,61 ± 0,26%, rispettivamente, mentre chì a densità in e cellule trattate cù DMSO era di 1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Quessi risultati cuntrastanu cù l'effetti di a propizamide, chì ùn influenza micca i filamenti d'actina, è a latrunculina B, un depolimerizzatore d'actina chì ùn influenza micca i microtubuli (Figura S6). Inoltre, u trattamentu cù cumamonamide 1, acidu cumamonamide 6, o KAND 11 ùn hà micca influenzatu i microtubuli in e cellule HeLa (Figura S7). Cusì, si crede chì u mecanismu d'azione di KAND 11 sia differente da quellu di i perturbatori di u citoscheletru cunnisciuti. Inoltre, a nostra osservazione microscopica di e cellule BY-2 trattate cù KAND 11 hà rivelatu l'iniziu di a morte cellulare durante u trattamentu KAND 11 è hà dimustratu chì a proporzione di cellule morte colorate cù u blu Evans ùn hè micca aumentata significativamente dopu à 30 minuti di trattamentu KAND 11, mentre chì dopu à 90 minuti di trattamentu cù 50 μM o 100 μM KAND, u numeru di cellule morte hè aumentatu à 43,7% o 80,1%, rispettivamente (Fig. 7c). Pigliati inseme, sti dati indicanu chì u novu derivatu di l'acidu ursolico KAND 11 hè un inhibitore di u citoscheletru specificu di a pianta cù un mecanismu d'azione prima scunnisciutu.
KAND affetta i microtubuli corticali, i filamenti d'actina è a viabilità di e cellule BY-2 di u tabaccu. (a) Visualizazione di i microtubuli corticali in e cellule BY-2 in presenza di TagRFP-TUA6. E cellule BY-2 trattate cù KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sò state esaminate per microscopia cunfocale. A densità di i microtubuli corticali hè stata calculata da micrografie di 25 cellule indipendenti. E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05). Barra di scala = 10 µm. (b) Filamenti di actina corticali in cellule BY-2 visualizzate in presenza di GFP-ABD2. E cellule BY-2 trattate cù KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sò state esaminate per microscopia cunfocale. A densità di i filamenti di actina corticali hè stata calculata da micrografie di 25 cellule indipendenti. E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05). Barra di scala = 10 µm. (c) Osservazione di e cellule BY-2 morte per colorazione cù blu Evans. E cellule BY-2 trattate cù KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO sò state esaminate per microscopia à campu chjaru. n = 3. Barra di scala = 100 µm.
A scuperta è l'applicazione di novi prudutti naturali hà purtatu à progressi significativi in vari aspetti di a vita umana, cumprese a medicina è l'agricultura. A ricerca storica hè stata realizata per ottene cumposti utili da risorse naturali. In particulare, l'attinomiceti sò cunnisciuti per esse utili cum'è antibiotici antiparassitari per i nematodi per via di a so capacità di pruduce diversi metaboliti secundarii cum'è l'avermectina, u compostu principale di l'ivermectina è a bleomicina è i so derivati, usati medicinalmente cum'è agente anticancerosu21,22. In listessu modu, una varietà di cumposti erbicidi sò stati scuperti da l'attinomiceti, alcuni di i quali sò digià usati cummercialmente1,23. Dunque, l'analisi di i metaboliti di l'attinomiceti per isolà i prudutti naturali cù attività biologiche desiderate hè cunsiderata una strategia efficace. In questu studiu, avemu scupertu un novu compostu, a cumamonamide, da S. werraensis è l'avemu sintetizatu cù successu. L'acidu ursonicu hè un intermediu sinteticu di l'urbenamide è i so derivati. Pò causà un arricciamentu radiculare caratteristicu, mustrà una attività erbicida da moderata à forte, è dannà direttamente o indirettamente i microtubuli di e piante. Tuttavia, u mecanismu d'azione di l'acidu urmotonicu pò esse differente da quellu di l'inibitori di microtubuli esistenti, postu chì KAND 11 interrompe ancu i filamenti di actina è provoca a morte cellulare, ciò chì suggerisce un mecanismu regulatoriu per u quale l'acidu urmotonicu è i so derivati influenzanu una vasta gamma di strutture citoscheletriche.
Una caratterizazione più dettagliata di l'acidu urbenonicu aiuterà à capisce megliu u mecanismu d'azione di l'acidu urbenonicu. In particulare, u prossimu scopu hè di valutà a capacità di l'acidu ursonicu di ligà si à i microtubuli ridutti per determinà se l'acidu ursonicu è i so derivati agiscenu direttamente nantu à i microtubuli è li depolimerizanu, o se a so azzione porta à a destabilizazione di i microtubuli. Inoltre, in u casu induve i microtubuli ùn sò micca un bersagliu direttu, identificà u situ d'azione è i bersagli moleculari di l'acidu ursonicu nantu à e cellule vegetali aiuterà à capisce megliu e proprietà di i cumposti correlati è i pussibuli modi per migliurà l'attività erbicida. U nostru test di bioattività hà rivelatu a capacità citotossica unica di l'acidu ursonicu nantu à a crescita di piante cum'è Arabidopsis thaliana, tabaccu è epatica, mentre chì nè E. coli nè e cellule HeLa sò state affettate. Poca o nisuna tossicità per e cellule animali hè un vantaghju di i derivati di l'acidu ursonicu s'elli sò sviluppati cum'è erbicidi per l'usu in campi agriculi aperti. Infatti, postu chì i microtubuli sò strutture cumuni in l'eucarioti, a so inibizione selettiva in e piante hè un requisitu chjave per l'erbicidi. Per esempiu, a propizamide, un agente depolimerizzante di microtubuli chì si lega direttamente à a tubulina è inibisce a polimerizazione, hè aduprata cum'è erbicida per via di a so bassa tossicità per e cellule animali24. À u cuntrariu di a disopiramide, i benzamidi correlati anu diverse specificità di bersagliu. In più di i microtubuli vegetali, RH-4032 o benzoxamide inibisce ancu i microtubuli di e cellule animali o oomiceti, rispettivamente, è a zalilamide hè aduprata cum'è fungicida per via di a so bassa fitotossicità25,26,27. L'orsu appena scupertu è i so derivati mostranu citotossicità selettiva contr'à e piante, ma vale a pena nutà chì ulteriori mudificazioni ponu alterà a so specificità di bersagliu, furnendu potenzialmente derivati supplementari per u cuntrollu di funghi patogeni o oomiceti.
E proprietà uniche di l'acidu urbenonicu è di i so derivati sò utili per u so sviluppu cum'è erbicidi è l'usu cum'è strumenti di ricerca. L'impurtanza di u citoscheletru in u cuntrollu di a forma di e cellule vegetali hè largamente ricunnisciuta. Studi precedenti anu dimustratu chì e piante anu sviluppatu meccanismi cumplessi di urganizazione di i microtubuli corticali cuntrullendu a dinamica di i microtubuli per cuntrullà currettamente a morfogenesi. Un gran numeru di molecule rispunsevuli di a regulazione di l'attività di i microtubuli sò state identificate, è a ricerca correlata hè sempre in corsu3,4,28. A nostra cunniscenza attuale di a dinamica di i microtubuli in e cellule vegetali ùn spiega micca cumpletamente i meccanismi di l'urganizazione di i microtubuli corticali. Per esempiu, ancu s'è sia a disopiramide sia l'oryzalin ponu depolimerizà i microtubuli, a disopiramide provoca una forte distorsione di e radiche mentre chì l'oryzalin hà un effettu relativamente lieve. Inoltre, e mutazioni in a tubulina, chì stabilizza i microtubuli, causanu ancu destrorotazione in e radiche, mentre chì u paclitaxel, chì stabilizza ancu a dinamica di i microtubuli, ùn a face micca. Dunque, studià è identificà i bersagli moleculari di l'acidu ursolico duveria furnisce nuove intuizioni nantu à a regulazione di i microtubuli corticali di e piante. In listessu modu, i paragoni futuri di sustanzi chimichi chì sò efficaci per prumove una crescita distorta, cum'è a disopiramide, è sustanzi chimichi menu efficaci, cum'è l'oryzalin o l'acidu kumamotoricu, furniranu indizii nantu à cumu si verifica a crescita distorta.
Da l’altra parte, i riarrangiamenti di u citoscheletru ligati à a difesa sò un’altra pussibilità per spiegà a citotossicità di l’acidu ursonicu. L’infezzione di un patogenu o l’introduzione di un elicitore in e cellule vegetali qualchì volta provoca a distruzzione di u citoscheletru è a successiva morte cellulare29. Per esempiu, hè statu signalatu chì a criptoxantina derivata da l’oomiceti perturba i microtubuli è i filamenti di actina prima di a morte di e cellule di tabacco, simile à ciò chì accade cù u trattamentu KAND30,31. E similitudini trà e risposte di difesa è e risposte cellulari indotte da l’acidu ursonicu ci anu purtatu à ipotizà chì scatenanu prucessi cellulari cumuni, ancu s’è un effettu più veloce è più forte di l’acidu ursonicu chè a criptoxantina hè evidente. Tuttavia, studii anu dimustratu chì a disrupzione di i filamenti di actina prumove a morte cellulare spontanea, chì ùn hè micca sempre accumpagnata da a disrupzione di i microtubuli29. Inoltre, ferma da vede se u patogenu o l’elicitore provoca una crescita distorta di e radiche, cum’è facenu i derivati di l’acidu ursonicu. Cusì, a cunniscenza moleculare chì cullega e risposte di difesa è u citoscheletru hè un prublema attraente da affrontà. Sfruttendu a presenza di cumposti di bassu pesu moleculare ligati à l'acidu ursonicu, è ancu una gamma di derivati cù putenze variabili, puderanu furnisce opportunità per indirizzà meccanismi cellulari scunnisciuti.
Pigliati inseme, a scuperta è l'applicazione di novi cumposti chì modulanu a dinamica di i microtubuli furniranu metudi putenti per affruntà i cumplessi meccanismi moleculari chì sò à a basa di a determinazione di a forma di e cellule vegetali. In questu cuntestu, u cumpostu recentemente sviluppatu di l'acidu urmotonicu, chì affetta i microtubuli è i filamenti di actina è induce a morte cellulare, pò furnisce una opportunità per decifrà a cunnessione trà u cuntrollu di i microtubuli è questi altri meccanismi. Cusì, l'analisi chimica è biologica cù l'acidu urbenonicu ci aiuterà à capisce i meccanismi regulatori moleculari chì cuntrolanu u citoscheletru vegetale.
Inoculà S. werraensis MK493-CF1 in un matracciu Erlenmeyer di 500 mL cù deflettori chì cuntene 110 mL di mezu di semente custituitu da 2% (p/v) galattosiu, 2% (p/v) pasta Essence, 1% (p/v) cumpusizione Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (p/v) estrattu di mais (KOGOSTCH Co., Ltd., Giappone), 0,2% (p/v) (NH4)2SO4 è 0,2% CaCO3 in acqua deionizzata. (pH 7,4 prima di a sterilizazione). E culture di semente sò state incubate nantu à un agitatore rotativu (180 rpm) à 27°C per 2 ghjorni. Cultivazione di pruduzzione via fermentazione à statu solidu. A cultura di sementi (7 ml) hè stata trasferita in un matrazzu K-1 di 500 ml chì cuntene 40 g di mezu di pruduzzione custituitu da 15 g d'orzu pressatu (MUSO Co., Ltd., Giappone) è 25 g d'acqua deionizzata (pH micca aghjustatu prima di a sterilizazione). A fermentazione hè stata realizata à 30 °C à u bughju per 14 ghjorni. U materiale di fermentazione hè statu estrattu cù 40 ml/buttiglia d'EtOH è centrifugatu (1500 g, 4 °C, 10 min). U surnatante di cultura (60 ml) hè statu estrattu cù una mistura di 10% MeOH/EtOAc. U stratu urganicu hè statu evaporatu sottu pressione ridutta per ottene un residuu (59,5 mg), chì hè statu sottumessu à HPLC cù eluzione in gradiente (0-10 minuti: 90%) nantu à una colonna di fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lunghezza 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minuti: 90% H2O/CH3CN à 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35-45 minuti: 90% H2O/EtOH, 45-155 minuti: 90% H2O/EtOH à 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155-200 min: 100% EtOH) à una velocità di flussu di 1,5 ml/min, a cumamonamide (1, 36,0 mg) hè stata isolata cum'è una polvere amorfa bianca.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valore calculatu: 141.0659, valore misuratu: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
I graneddi di Columbia (Col-0) sò stati ottenuti da u Centru di Risorse Biologiche Arabidopsis (ABRC) cù l'autorizazione per l'usu di ricerca. I graneddi Col-0 sò stati propagati è mantenuti in e nostre cundizioni di laburatoriu è aduprati cum'è piante di Arabidopsis di tipu salvaticu. I graneddi d'Arabidopsis sò stati sterilizzati in superficia è cultivati in un mezu Murashige è Skoog à metà forza chì cuntene 2% di saccarosu (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) d'acidu 2-(4-morfolino)etansulfonicu (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) è 1,5% d'agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, à 23 °C è luce costante. I graneddi di u mutante phs1-1 sò stati furniti da T. Hashimoto (Istitutu di Scienza è Tecnulugia di Nara).
I graneddi di a ceppa SR-1 sò stati furniti da T. Hashimoto (Istitutu di Scienza è Tecnulugia di Nara) è aduprati cum'è piante di tabaccu di tipu salvaticu. I graneddi di tabaccu sò stati sterilizzati in superficia è immersi in acqua sterile per trè notti per prumove a germinazione, poi posti in una soluzione à metà forza chì cuntene 2% di saccarosu, 0,05% (p/v) MES è 0,8% di gomma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. è Skoog medium) cù pH 5,7 è incubati à 23°C sottu luce costante.
U ceppu Tak-1 hè statu furnitu da T. Kohchi (Università di Kyoto) è hè statu utilizatu cum'è unità sperimentale standard per u studiu di l'epatiche. A Gemma hè stata ottenuta da piante cultivate sterilizzate è poi piastrata nantu à u mezu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) chì cuntene 1% di saccarosu è 0,3% di gomma gellan è incubata à 23°C sottu luce cuntinua.
E cellule BY-2 di tabaccu (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) sò state furnite da S. Hasezawa (Università di Tokyo). E cellule BY-2 sò state diluite 95 volte in un mezu Linsmeier è Skoog mudificatu è supplementate settimanalmente cù l'acidu 2,4-diclorofenossiaceticu 32. A sospensione cellulare hè stata mischiata nantu à un agitatore rotativu à 130 rpm à 27°C à u bughju. Lavate e cellule cù 10 volte u vulume di mezu frescu è risospendete in u listessu mezu. E linee cellulari transgeniche BY-2 chì esprimenu stabilmente u marcatore di microtubuli TagRFP-TUA6 o u marcatore di filamenti di actina GFP-ABD2 sottu u promotore 35S di u virus di u mosaicu di u cavolfiore sò state generate cum'è descrittu33,34,35. Queste linee cellulari ponu esse mantenute è sincronizate aduprendu procedure simili à quelle aduperate per a linea cellulare BY-2 originale.
E cellule HeLa sò state cultivate in u mediu di Eagle mudificatu da Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) supplementatu cù 10% di serum fetale bovinu, 1,2 U/ml di penicillina è 1,2 μg/ml di streptomicina in un incubatore à 37°C cù 5% di CO2.
Tutti l'esperimenti descritti in questu manuscrittu sò stati realizati in cunfurmità cù e regulazioni è e linee guida giapponesi di biosicurezza.
I cumposti sò stati dissolti in dimetilsulfossido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) cum'è suluzioni stock è diluiti in mezu MS per Arabidopsis è tabacco o mezu Gamborg B5 per epatica. Per u test di inibizione di a crescita di e radiche, più di 10 semi per piastra sò stati suminati nantu à un mezu agar chì cuntene i cumposti indicati o DMSO. I semi sò stati incubati in una camera di crescita per 7 ghjorni. E piantine sò state fotografate è a lunghezza di e radiche hè stata misurata. Per u test di germinazione di Arabidopsis, 48 semi per piastra sò stati suminati nantu à un mezu agar chì cuntene 200 μM di cumpostu o DMSO. I semi di Arabidopsis sò stati cultivati in una camera di crescita è u numeru di piantine germinate hè statu cuntatu 7 ghjorni dopu a germinazione (dag). Per u test di germinazione di u tabacco, 24 semi per piastra sò stati suminati nantu à un mezu agar chì cuntene 200 μM di KAND o DMSO. I semi di tabacco sò stati cultivati in una camera di crescita è u numeru di piantine germinate hè statu cuntatu dopu à 14 ghjorni. Per u test d'inibizione di a crescita di l'epatiche, 9 embrioni da ogni piastra sò stati piastrati nantu à un mediu d'agar chì cuntene e concentrazioni indicate di KAND o DMSO è incubati in una camera di crescita per 14 ghjorni.
Aduprate piantine culurite cù 5 mg/ml di ioduro di propidiu (PI) per visualizà l'urganizazione di u meristema radicale. I signali PI sò stati osservati per microscopia à fluorescenza utilizendu un microscopiu à scansione laser cunfocale TCS SPE (Leica Microsystems).
A culurazione istochimica di e radiche cù β-glucuronidasi (GUS) hè stata realizata secondu u protocolu discrittu da Malami è Benfey36. E piantine sò state fissate in acetone à 90% per a notte, culurite cù 0,5 mg/ml di acidu 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucuronicu in tampone GUS per 1 ora è poste in una soluzione di cloraldeide idratata (8 g d'idrato di clorale, 2 ml d'acqua è 1 ml di glicerolo) è osservate per microscopia di cuntrastu di interferenza differenziale utilizendu un microscopiu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
L'anguli di e radiche sò stati misurati nantu à e piantine di 7 ghjorni cultivate nantu à piastre piazzate verticalmente. Misurate l'angulu di a radica da a direzzione di u vettore di gravità cum'è descrittu in u passu 6.
A dispusizione di i microtubuli corticali hè stata osservata cum'è descritta, cù mudificazioni minori à u protocolu 37. L'anticorpu anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) è l'IgG anti-topo cunjugatu cù Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) sò stati aduprati cum'è anticorpi primari è secundarii à diluizioni 1:1000 è 1:100, rispettivamente. L'imaghjini di fluorescenza sò state acquistate aduprendu un microscopiu à scansione laser cunfocale TCS SPE (Leica Microsystems). Acquisite imaghjini Z-stack è create pruiezioni di massima intensità secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
U test di proliferazione cellulare HeLa hè statu realizatu cù u Cell Counting Kit 8 (Dojindo) secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
A crescita di E. coli DH5α hè stata analizata misurendu a densità cellulare in cultura cù un spettrofotometru à 600 nm (OD600).
L'urganizazione citoscheletrica in e cellule transgeniche BY-2 hè stata osservata aduprendu un microscopiu à fluorescenza equipatu cù un dispositivu di scansione cunfocale CSU-X1 (Yokogawa) è una camera sCMOS (Zyla, Andor Technology). A densità citoscheletrica hè stata valutata per analisi di l'imagine, chì hà quantificatu a percentuale di pixel citoscheletrici trà i pixel citoplasmatici in l'imagine cunfocali aduprendu u software ImageJ cum'è descrittu38,39.
Per rilevà a morte cellulare in e cellule BY-2, una aliquota di a sospensione cellulare hè stata incubata cù 0,05% di blu Evans per 10 minuti à temperatura ambiente. A culurazione selettiva di u blu Evans di e cellule morte dipende da l'estrusione di u colorante da e cellule viabili da a membrana plasmatica intatta40. E cellule culurite sò state osservate cù un microscopiu à campu chjaru (BX53, Olympus).
E cellule HeLa sò state cultivate in DMEM supplementatu cù 10% FBS in un incubatore umidificatu à 37°C è 5% CO2. E cellule sò state trattate cù 100 μM KAND 11, acidu kumamonamicu 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), o 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) per 6 ore à 37°C. E cellule sò state fissate cù MetOH per 10 minuti è dopu cù acetatu per 5 minuti à temperatura ambiente. E cellule fissate sò state incubate cù anticorpu primariu β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluitu in 0,5% BSA/PBS per 2 ore, lavate 3 volte cù TBST, è dopu incubate cù anticorpu di capra Alexa Fluor. 488 1 ora. – IgG di topo (Thermo Fisher Scientific: A11001) è 15 ng/ml di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) diluitu in 0,5% BSA/PBS. Dopu avè lavatu cù TBST trè volte, e cellule culurite sò state osservate nantu à un microscopiu inversu Nikon Eclipse Ti-E. L'imagine sò state catturate cù una camera CCD Hamamatsu ORCA-R2 raffreddata utilizendu u software MetaMorph (Molecular Devices).
Data di publicazione: 17 di ghjugnu 2024