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A scuperta è l'usu beneficu di i prudutti naturali pò aiutà à migliurà a vita umana. I sustanzi chimichi inhibitori di a crescita di e piante sò largamente usati com'è erbicidi per cuntrullà e erbacce. A causa di a necessità di utilizà diversi tipi di erbicidi, ci hè bisognu di identificà cumposti cù novi miccanismi d'azzione. In questu studiu, avemu scupertu un novu compostu N -alkoxypyrrole, cumamonamide, da Streptomyces werraensis MK493-CF1 è stabilitu u prucessu di sintesi cumpletu. Attraversu analisi di attività biologica, avemu scupertu chì l'acidu urs-monoamic hè un intermediariu sinteticu di urs-monoamide è un putenziale.inhibitore di crescita di e piante. Inoltre, avemu sviluppatu diversi derivati di l'acidu urbenonicu, cumpresu u derivativu urbenyloxy (UDA), chì hà una alta attività erbicida senza affettà negativamente a crescita di e cellule HeLa. Avemu trovu ancu chì i derivati di l'acidu urmotonicu disturbanu i microtubuli di a pianta; in più, KAND affetta i filamenti di actina è induce a morte cellulare; Questi effetti multifaceted differ da quelli di l'inhibitori microtubuli cunnisciuti è suggerenu un novu mecanismu d'azzione per l'acidu ursonicu, chì rapprisenta un vantaghju impurtante in u sviluppu di novi erbicidi.
A scuperta è l'applicazione pratica di i prudutti naturali benifichi è i so derivati hè un mezzu per migliurà a qualità di a vita umana. I metaboliti secundarii pruduciuti da i microorganismi, i pianti è l'insetti anu purtatu à grandi progressi in a medicina è l'agricultura. Parechji antibiotici è droghe anti-leucemia sò stati sviluppati da i prudutti naturali. Inoltre, diversi tipi dipesticidi, fungicidi è erbicidi sò estratti da questi prudutti naturali per l'usu in l'agricultura. In particulare, l'erbicidi di cuntrollu di erbaccia sò arnesi impurtanti per aumentà a pruduzzioni di culturi in l'agricultura muderna, è parechji tipi di cumposti sò digià utilizati cummerciale. Diversi prucessi cellulari in e piante, cum'è a fotosintesi, u metabolismu di l'aminoacidu, a sintesi di u muru cellulare, a regulazione di a mitosi, a signalazione di fitohormone, o a sintesi di prutezione, sò cunsiderate target tipici di l'erbicidi. I composti chì inibiscenu a funzione di i microtubuli sò una classe cumuna di erbicidi chì affettanu a crescita di e piante affettendu a regulazione mitotica2.
I microtubuli sò cumpunenti di u citoscheletru è sò largamente conservati in e cellule eucariote. L'eterodimero di tubulina consiste di α-tubulina e β-tubulina che formano protofilamenti di microtubuli lineari, con 13 protofilamenti che formano una struttura cilindrica. I microtubuli ghjucanu parechji roli in e cellule vegetali, cumprese a determinazione di a forma di e cellule, a divisione cellulare è u trasportu intracellulare3,4. E cellule vegetali cuntenenu microtubuli sottu à a membrana di plasma di l'interfase, è questi chjamati microtubuli corticali sò pensati per cuntrullà l'urganizazione di microfibri di cellulosa per mezu di a regulazione di complexi di cellulosa sintasi4,5. I microtubuli corticale di e cellule epidermiche radicali, prisenti in a zona di allungamentu rapidu di a punta di a radica, sò situati lateralmente, è e microfibres di cellulosa seguenu sti microtubuli è limitanu a direzzione di l'espansione di e cellule, favurendu cusì l'allungamentu anisotropicu di e cellule. Dunque, a funzione di i microtubuli hè strettamente ligata à a morfologia di a pianta. Sustituzioni di l'aminoacidi in i geni chì codificanu a tubulina causanu skew di l'arrays di microtubuli corticali è a crescita à a manca o à a diritta in Arabidopsis 6,7. In listessu modu, mutazioni in e proteine associate à i microtubuli chì regulanu a dinamica di i microtubuli ponu ancu purtà à a crescita di e radici distorte8,9,10,11,12,13. Inoltre, u trattamentu cù l'erbicidi chì interferiscenu cù i microtubuli, cum'è a disopiramide, ancu cunnisciutu com'è pretilachloru, pruvucarà ancu a crescita di a radica obliqua di a sinistra14. Questi dati indicanu chì a regulazione precisa di a funzione di i microtubuli hè critica per a determinazione di a direzzione di a crescita di e piante.
Diversi tipi d'inhibitori di microtubuli sò stati scuperti, è questi droghe anu fattu cuntributi significativi à a ricerca citoscheletrica, è ancu à l'agricultura è a medicina2. In particulare, l'oryzalin, i cumposti di dinitroaniline, a disopiramide, i composti di benzamide, è i so analoghi ponu inibisce a funzione di i microtubuli è cusì impediscenu a crescita di e piante. Per quessa, sò largamente usati com'è erbicidi. Tuttavia, postu chì i microtubuli sò un cumpunente impurtante di e cellule vegetali è animali, a maiò parte di l'inibitori di i microtubuli sò citotossichi per i dui tipi di cellule. Dunque, malgradu a so utilità ricunnisciuta cum'è erbicidi, un numeru limitatu di agenti antimicrotubuli sò usati per scopi pratichi.
Streptomyces hè un genus di a famiglia Streptomyces, chì include battìri aerobichi, gram-positivi, filamentosi è hè largamente cunnisciutu per a so capacità di pruduce una larga gamma di metaboliti secundari. Per quessa, hè cunsideratu una di e fonti più impurtanti di novi prudutti naturali biologicamente attivi. In u studiu attuale, avemu scupertu un novu compostu chjamatu cumamonamide, chì hè stata isolata da Streptomyces werraensis MK493-CF1 è S. werraensis ISP 5486. Utilizendu l'analisi spettrali è l'analisi spettrali cumpletu, a struttura di cumamonamide hè stata carattarizata è u so scheletru unicu N-alkoxypyrrole hè statu determinatu. sintesi. L'acidu ursmonicu, un intermediu sinteticu di l'ursmonoamide è i so derivati, hè stata trovata per inibisce a crescita è a germinazione di a pianta populari Arabidopsis thaliana. In un studiu di relazione struttura-attività, truvamu chì un compostu cù C9 mudificatu à l'acidu ursonicu, chjamatu nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), aumenta significativamente l'effettu inhibitori nantu à a crescita è a germinazione. In particulare, l'inhibitore di a crescita di a pianta di novu scupertu hà ancu affettatu a crescita di tabacco è liverwort è ùn era micca citotossicu per i batteri o e cellule HeLa. Inoltre, certi derivati di l'acidu urmotonicu inducenu un fenotipu radicali distortu, chì implica chì sti derivati affettanu direttamente o indirettamente i microtubuli. In cunfurmità cù questa idea, e nostre osservazioni di i microtubuli marcati sia immunoistochimicamente sia cù proteine fluorescenti indicanu chì u trattamentu KAND depolimerizza i microtubuli. Inoltre, u trattamentu cù derivati di l'acidu kumamotonic disrupted microfilaments actin. Cusì, avemu scupertu un novu inhibitore di a crescita di a pianta chì u so mecanismu unicu d'azzione implica a distruzzione di u citoscheletru.
A ceppa MK493-CF1 hè stata isolata da a terra in Shinagawa-ku, Tokyo. A ceppa MK493-CF1 hà furmatu miceliu stromal ben ramificato. A sequenza parziale di u genu di RNA ribosomali 16S (1422 bp) hè stata determinata. Stu strain hè assai simili à S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: strain tipicu, 99,93%). Basatu annantu à stu risultatu, hè statu determinatu chì sta ceppa era strettamente ligata à u tipu di ceppa di S. werraensis. Per quessa, avemu pruvisoriamente chjamatu sta ceppa S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T pruduce ancu i stessi composti bioattivi. Siccomu ci era pocu prima ricerca per ottene prudutti naturali da stu microorganismu, più ricerca chimica hè stata realizata. Dopu à u cultivo di S. werraensis MK493-CF1 nantu à u mediu d'orzu da a fermentazione solidu à 30 ° C per 14 ghjorni, u mediu hè stata estratta cù 50% EtOH. 60 ml di mostra hè stata secca per ottene 59,5 mg di extracte crudo. L'estrattu crudu hè statu sottumessu à HPLC in fase inversa per dà N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, chjamatu cumamonamide, 36,0 mg). A quantità tutale di 1 hè circa 60% di l'estrattu crudu. Dunque, avemu decisu di studià in dettaglio e proprietà di kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 hè un pezzu amorfu biancu è spettrometria di massa d'alta risoluzione (HRESIMS) cunfirma C6H8N2O2 (Fig. 1). U frammentu di pirrolu C2-sustituitu di stu compostu hè carattarizatu da δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH in 1H RMN spettru: 4.5 Hz, H-5, δ, 5.8, H-5. Hz, H-6), è u spettru 13C NMR mostra a prisenza di quattru atomi di carbonu sp2. A prisenza di un gruppu amide in a pusizione C2 hè stata valutata da a correlazione HMBC da u protone C-3 à u carbonile amide carbonyl à δC 161.1. Inoltre, i picchi di 1 H è 13 C RMN à δH 4.10 (3H, S) è δC 68.3 indicanu a presenza di gruppi N-metossi in a molécula. Ancu s'è a pusizione curretta di u gruppu metossi ùn era micca stata determinata cù l'analisi spettroscòpica cum'è a spettroscopia di differenza rinfurzata è l'abbreviazione nucleare Overhauser (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide diventò u primu compostu candidatu.
Per determinà a struttura curretta di 1, una sintesi tutale hè stata realizata (Fig. 2a). U trattamentu di 2-aminopyridine 2 dispunibule in u cummerciu cù m-CPBA hà risultatu in u N-oxide 3 currispundente in u rendiment quantitatiu. Dopu à a 2-aminoazidation di 2, a reazione di ciclocondensazione descritta da Abramovich hè stata realizata in benzene à 90 ° C per ottene u 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile desideratu 5 in grammi. Velocità 60% (duie tappe). 15,16. A metilazione è l'idrolisi di 4 hà datu l'acidu 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (chjamatu "cumotonic acid", 6) in bonu rendiment (70%, dui passi). Infine, l'amidazione via l'intermediu di cloruru di l'acidu 6 cù l'ammonia aqueous hà datu l'amida di Kumamoto 1 in un rendimentu di 98%. Tutti i dati spettrali di sintesi 1 eranu simili à isolati 1, cusì a struttura di 1 hè stata determinata;
Sintesi generale è analisi di l'attività biologica di l'urbenamide è l'acidu urbenic. (a) Sintesi totale di Kumamoto amide. (b) I piantini di Arabidopsis Columbia (Col) di tipu salvaticu di sette ghjorni sò stati cultivati nantu à i platti Murashige è Skoog (MS) chì cuntenenu cumamonamide 6 o cumamonamide 1 à a cuncentrazione indicata. Scala bar = 1 cm.
Prima, avemu evaluatu l'attività biologica di l'urbenamide è i so intermedii per a so capacità di modulà a crescita di e piante. Avemu aghjustatu diverse concentrazioni di ursmonamide 1 o l'acidu ursmonicu 6 à MS agar medium è cultivate piantini di Arabidopsis thaliana nantu à questu mediu. Questi saggi anu dimustratu chì e cuncintrazioni elevate (500 μM) di 6 inhibited root growth (Fig. 2b). In seguitu, avemu generatu diversi derivati sustituendu a pusizione N1 di 6 è eseguite studii di relazione struttura-attività nantu à elli (u prucessu di sintesi analogica hè descritta in l'Informazione di Supportu (SI)). I piantini di Arabidopsis sò stati cultivati nantu à un mediu chì cuntene 50 μM derivati di l'acidu ursonicu, è a lunghezza di a radica hè stata misurata. cum'è mostra nantu à a stampa. Cum'è mostra in Figure 3a, b, è S1, l'acidi cumamo anu diverse lunghezze di catene alcossi lineari (9, 10, 11, 12 è 13) o catene alcossi grandi (15, 16 è 17) à a pusizione N1. I derivati anu dimustratu una inhibizione significativa di a crescita radicali. Inoltre, avemu truvatu chì l'applicazione di 200 μM 10, 11, o 17 hà impeditu a germinazione (Figs. 3c è S2).
Studiu di a relazione struttura-attività di Kumamoto amide è composti rilativi. (a) Struttura è schema di sintesi di analoghi. (b) Quantificazione di a lunghezza di a radica di piantini di 7 ghjorni cultivati in MS medium cù o senza derivati cumamonamide 50 μM. L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05). n>18. I dati sò indicati cum'è media ± SD. nt significa "micca pruvatu" perchè più di 50% di e sementi ùn anu micca germinatu. (c) Quantificazione di a rata di germinazione di e sementi trattati incubati per 7 ghjorni in MS medium cù o senza 200 μM cumamonamide è composti rilativi. L'asterischi indicanu differenzi significati cù u trattamentu simulatu (test chi-square). n = 96.
Curiosamente, l'aghjunzione di catene laterali alchili più longu di C9 hà riduciutu l'attività inibitoria, suggerenu chì i composti di l'acidu kumamotoic necessitanu catene laterali di una certa dimensione per esibisce a so attività biologica.
Perchè l'analisi di a relazione struttura-attività hà dimustratu chì C9 hè statu mudificatu à l'acidu ursonicu è u derivatu nonyloxy di l'acidu ursonicu (in seguitu chjamatu KAND 11) era l'inhibitore di crescita di a pianta più efficace, avemu realizatu una carattarizazione più dettagliata di KAND 11. Trattamentu di Arabidopsis cù 50 μM KAND 11 induve quasi completamente impeditu a cuncentrazione 2,30, 40, o germinazione più bassa (40,40). 10 μM) di KAND 11 inibite a crescita radicali in una manera di dosi-dependent (Fig. 4a, b). Per pruvà se KAND 11 affetta a viabilità di i meristemi radicali, avemu esaminatu i meristemi radicali macchiati cù ioduru di propidium (PI) è misurate a dimensione di l'area di meristemi. A dimensione di u meristem di piantini cultivati nantu à un mediu chì cuntene 25 μM KAND-11 era 151.1 ± 32.5 μm, mentri a dimensione di u meristem di piantini cultivati nantu à un mediu di cuntrollu chì cuntene DMSO era 264.7 ± 30.8 μM KAND-11, chì indicanu chì l'attività di KAND-14s (Fig. sparghje. Meristema radice. In cunfurmità cù questu, u trattamentu KAND 11 hà riduciutu a quantità di u marcatu di divisione cellula CDKB2; 1p::CDKB2; 1-GUS signal in u meristemu radicali (Fig. 4e) 17 . Questi risultati indicanu chì KAND 11 inibisce a crescita di e radici riducendu l'attività di proliferazione cellulare.
Analisi di l'effettu inhibitori di i derivati di l'acidu urbenonicu (derivati urbenyloxy) nantu à a crescita. (a) Seedlings di Col salvaticu di 7 ghjorni cultivati nantu à i platti MS cù a cuncentrazione indicata di KAND 11. Scale bar = 1 cm. (b) Quantificazione di a lunghezza di a radica. E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05). n>16. I dati sò indicati cum'è media ± SD. (c) Microscopia Confocal di iodudu di propidium-stained-tipu salvaticu Col razzi cultivati nantu à i platti MS cù o senza 25 μM KAND 11. I brackets bianchi indicanu meristema di a radica. Barre d'échelle = 100 µm. (d) Quantificazione di a dimensione di u meristemu radicali (n = 10 à 11). E differenze statistiche sò state determinate cù u test t (p< 0,05). I bars rapprisentanu a dimensione media di meristema. (e) Microscopia di cuntrastu di interferenza differenziale (DIC) di un meristemu radicali chì cuntene u custruttu CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS macchiatu è macchiatu nantu à piantini di 5 ghjorni cultivati nantu à piastre MS cù o senza test KAND 25 µM.
A fitotossicità di KAND 11 hè stata ulteriormente testata cù una altra pianta dicotiledona, tabacco (Nicotiana tabacum), è un urganismu maiò di u mudellu di pianta di terra, liverwort (Marchantia polymorpha). Cum'è in u casu di Arabidopsis, e piantini di tabacco SR-1 cultivate nantu à u mediu chì cuntene 25 μM KAND 11 pruducia razzi più brevi (Fig. 5a). Inoltre, 40 di 48 sementi germinati nantu à platti chì cuntenenu 200 μM KAND 11, mentre chì tutti i 48 sementi germinavanu nantu à i media trattati cù simulazione, chì indicanu chì concentrazioni più elevate di KAND eranu significative (p< 0,05; chi test -square) hà impeditu a germinazione di u tabacco. (Fig. 5b). Inoltre, a cuncentrazione di KAND 11 chì inibisce a crescita bacteriana in liverwort era simili à a cuncentrazione efficace in Arabidopsis (Fig. 5c). Questi risultati indicanu chì KAND 11 pò impedisce a crescita di una varietà di piante. Dopu avemu investigatu a pussibuli citotossicità di i composti di l'orsu monoamide in altri organismi, vale à dì e cellule HeLa umane è Escherichia coli ceppa DH5α, cum'è rapprisentanti di cellule animali è batteriche superiore, rispettivamente. In una seria di test di proliferazione cellulare, avemu osservatu chì cumamonamide 1, cumamonamidic acid 6 è KAND 11 ùn anu micca affettatu u crescita di e cellule HeLa o E. coli à cuncentrazione di 100 μM (Fig. 5d, e).
Inibizione di crescita di KAND 11 in organismi non-Arabidopsis. (a) I piantini di tabacco SR-1 di tipu salvaticu di duie settimane sò stati cultivati nantu à platti MS posizionati verticalmente chì cuntenenu 25 μM KAND 11. (b) I piantini di tabacco SR-1 di tipu salvaticu di duie settimane sò stati cultivati nantu à platti MS posizionati horizontalmente chì cuntenenu 200 μM KAND-1-1-week-1. liverwort buds cultivati nantu à i platti Gamborg B5 cù a cuncentrazione indicata di KAND 11. I frecce rossi indicanu spori chì anu cessatu di crescenu in u periodu di incubazione di duie settimane. (d) Test di proliferazione cellulare di cellule HeLa. U nùmeru di cellule viable hè stata misurata à intervalli di tempu fissi utilizendu un kit di cuntazione di cellule 8 (Dojindo). Comu cuntrollu, e cellule HeLa sò state trattate cù 5 μg/ml actinomicina D (Act D), chì inibisce a trascrizione di RNA polimerasi è provoca a morte cellulare. L'analisi sò state realizate in triplicate. (e) Test di proliferazione cellulare di E. coli. A crescita di E. coli hè stata analizata da a misurazione di OD600. Comu cuntrollu, e cellule sò state trattate cù 50 μg/ml ampicillin (Amp), chì inibisce a sintesi di u muru di a cellula bacteriana. L'analisi sò state realizate in triplicate.
Per decifrare u miccanisimu di l'azzione di a citotossicità causata da i cumposti ligati à l'uramide, avemu rianalizzatu i derivati di l'acidu urbenic cù effetti inhibitori moderati. cum'è mostra nantu à a stampa. Cum'è mostra in Figure 2b, 6a, e piantini cultivati nantu à i platti d'agar chì cuntenenu alta concentrazione (200 μM) di l'acidu urmotonicu 6 pruducianu radiche più curtite è curve à manca (θ = – 23,7 ± 6,1), mentre chì di e piantini cultivati nantu à u mediu di cuntrollu, i piantini pruducianu quasi dritti (θ = –. Questa crescita obliqua caratteristica hè cunnisciuta per esse risultatu da a disfunzione di i microtubuli corticali14,18. In cunfurmità cù questa scuperta, a droga di disopiramida è l'oryzalin disstabilizzanti di i microtubuli inducevanu una inclinazione di a radica simile in i nostri cundizioni di crescita (Figs. 2b, 6a). À u listessu tempu, avemu pruvatu i derivati di l'acidu urmotonicu è selezziunate parechji di elli chì, à certe cuncentrazioni, inducevanu a crescita di e radiche oblique. I cumposti 8, 9 è 15 anu cambiatu a direzzione di a crescita radicali à 75 μM, 50 μM è 40 μM, rispettivamente, chì indicanu chì questi cumposti ponu effittivamenti destabilizà i microtubuli (Fig. 2b, 6a). Avemu ancu pruvatu u derivatu di l'acidu ursolic più putente, KAND 11, à una cuncentrazione più bassa (15 µM) è truvamu chì l'applicazione di KAND 11 inibisce a crescita di e radici è chì a direzzione di a crescita di e radici era irregolare, ancu s'ellu tendenu à pendenza à a manca (Figura C3). . Perchè e concentrazioni più elevate di droghe destabilizzanti di i microtubuli a volte inibiscenu a crescita di e piante piuttostu chè causanu l'inclinazione di e radici, in seguitu avemu valutatu a pussibilità chì KAND 11 affetta i microtubuli osservendu i microtubuli corticali in e cellule epidermiche radicali. Immunohistochemistry cù l'anticorpi anti-β-tubulin in i celluli epidermali di e radichi di piantini trattati cù 25 μM KAND 11 hà dimustratu a scumparsa di quasi tutti i microtubuli corticale in i celluli epidermali in a zona di allungamentu (Fig. 6b). Questi risultati indicanu chì l'acidu kumamotonic è i so derivati agiscenu direttamente o indirettamente nantu à i microtubuli per disrupti è chì questi composti sò novi inhibitori di microtubuli.
L'acidu ursonicu è i so derivati alteranu i microtubuli corticali in Arabidopsis thaliana. (a) Angulu d'inclinazione radicali misuratu in presenza di diversi derivati di l'acidu urmotonicu à e cuncentrazioni indicate. L'effetti di dui composti cunnisciuti per inibisce i microtubuli: disopyramide è oryzalin sò stati ancu analizati. L'inseritu mostra u standard utilizatu per misurà l'angolo di crescita radicali. L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05). n>19. Scale bar = 1 cm. (b) Microtubuli corticali in cellule epidermiche in a zona di allungamentu. I microtubuli in e radici di Arabidopsis Col di tipu salvaticu cultivati nantu à piastre MS cù o senza 25 μM KAND 11 sò stati visualizati da colorazione immunoistochimica utilizendu anticorpi primari β-tubulina è anticorpi secundarii Alexa Fluor-conjugated. Barre d'échelle = 10 µm. (c) Struttura mitotica di i microtubuli in u meristema radicali. I microtubuli sò stati visualizati cù a tintura immunoistochimica. Strutture mitotiche, cumprese zoni di profase, spindles è phragmoplasts, sò stati cuntati da l'imaghjini cunfocali. Le frecce indicano strutture mitotiche di microtubuli. L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05). n>9. Scala bar = 50 µm.
Ancu Ursa hà a capacità di disturbà a funzione di i microtubuli, u so mecanismu d'azzione hè previstu per esse sfarente da l'agenti depolimerizzanti tipici di i microtubuli. Per esempiu, concentrazioni più elevate di agenti depolimerizzanti di microtubuli cum'è disopiramide è orizalina inducenu espansione anisotropica di e cellule epidermiche, mentri KAND 11 ùn hè micca. Inoltre, a co-applicazione di KAND 11 è disopyramide hà risultatu in una risposta di crescita di a radica indotta da disopiramida è l'inhibizione di a crescita inducida da KAND 11 hè stata osservata (Fig. S4). Avemu ancu analizatu a risposta di a disopiramida ipersensibile 1-1 (phs1-1) mutante à KAND 11. phs1-1 hà una mutazione di puntu di tubulin kinase non canonica è pruduce radichi più brevi quandu si tratta cù disopyramide9,20. phs1-1 mutanti muderni cultivati nantu à agar medium chì cuntenenu KAND 11 avianu radichi più brevi simili à quelli cultivati in disopyramid (fig. S5).
Inoltre, avemu osservatu strutture di microtubuli mitotichi, cum'è e zoni di profase, spindles è phragmoplasts, in u meristemu radicali di e piantini trattati cù KAND 11. In cunfurmità cù l'osservazioni per CDKB2; 1p:: CDKB2; 1-GUS, una diminuzione significativa in u numeru di microtubuli mitotichi hè stata osservata (Fig. 6c).
Per caratterizà a citotossicità di KAND 11 à a risoluzione subcellulare, avemu trattatu e cellule di sospensione di tabacco BY-2 cù KAND 11 è osservatu a so risposta. Prima avemu aghjustatu KAND 11 à e cellule BY-2 chì esprimenu TagRFP-TUA6, chì marca fluorescente i microtubuli, per valutà l'effettu di KAND 11 nantu à i microtubuli corticali. A densità di i microtubuli corticali hè stata valutata cù l'analisi di l'imaghjini, chì quantificava a percentuale di pixel citoscheletali trà i pixel citoplasmatici. I risultati di l'assay anu dimustratu chì dopu à u trattamentu cù 50 μM o 100 μM KAND 11 per 1 ora, a densità diminuì significativamente à 0.94 ± 0.74% o 0.23 ± 0.28%, rispettivamente, mentre chì a densità di e cellule trattate cù DMSO, ammontava à ± 1.0.74 . Questi risultati sò cunsistenti cù l'osservazione in Arabidopsis chì u trattamentu KAND 11 induce a depolimerizazione di i microtubuli corticale (Fig. 6b). Avemu ancu esaminatu a linea BY-2 cù filamenti d'actina marcati GFP-ABD dopu u trattamentu cù a stessa cuncentrazione di KAND 11 è osservatu chì u trattamentu KAND 11 hà disturbatu i filamenti d'actina. U trattamentu cù 50 μM o 100 μM KAND 11 per 1 h hà riduciutu significativamente a densità di filamenti di actina à 1.20 ± 0.62% o 0.61 ± 0.26%, rispettivamente, mentre chì a densità in cellule trattate cù DMSO era 1.69 ± 0.69% (Fig. 7b). Questi risultati cuntrastanu cù l'effetti di propyzamide, chì ùn affetta micca i filamenti di actina, è di latrunculin B, un depolymerizer d'actina chì ùn affetta micca i microtubuli (SI Figura S6). Inoltre, u trattamentu cù cumamonamide 1, cumamonamide acid 6, o KAND 11 ùn hà micca affettatu i microtubuli in e cellule HeLa (SI Figura S7). Cusì, u mecanismu di l'azzione di KAND 11 hè credutu chì hè diversu da quellu di i disruptori di citoscheletru cunnisciuti. Inoltre, a nostra osservazione microscòpica di e cellule BY-2 trattate cù KAND 11 hà revelatu l'iniziu di a morte cellulare durante u trattamentu KAND 11 è hà dimustratu chì a proporzione di cellule morte di Evans blu-stained ùn hà micca aumentatu significativamente dopu à 30 min di trattamentu KAND 11, mentre chì dopu à 90 minuti di trattamentu cù 50 μM o KAD 104% di u numeru di cellule di 104 μM. o 80,1%, rispettivamente (Fig. 7c). Inseme, sti dati indicanu chì u novu derivatu di l'acidu ursolicu KAND 11 hè un inhibitore citoscheleticu specificu di a pianta cù un mecanismu d'azzione prima scunnisciutu.
KAND affetta i microtubuli corticali, i filamenti di actina è a viabilità di e cellule BY-2 di tabacco. (a) Visualizzazione di microtubuli corticali in cellule BY-2 in presenza di TagRFP-TUA6. Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie confocale. A densità di i microtubuli corticali hè stata calculata da micrografie di 25 cellule indipendenti. E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05). Barre d'échelle = 10 µm. (b) Filamenti di actina corticale in cellule BY-2 visualizzate in presenza di GFP-ABD2. Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie confocale. A densità di filamenti di actina corticale hè stata calculata da micrografie di 25 cellule indipendenti. E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05). Barre d'échelle = 10 µm. (c) Osservazione di cellule BY-2 morte da colorazione blu Evans. Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie à champ clair. n = 3. Barre d'échelle = 100 µm.
A scuperta è l'applicazione di novi prudutti naturali hà purtatu à avanzamenti significativi in parechji aspetti di a vita umana, cumpresa a medicina è l'agricultura. A ricerca storica hè stata fatta per ottene composti utili da e risorse naturali. In particulare, l'actinomycetes sò cunnisciuti per esse utili com'è antibiotici antiparassitarii per i nematodi per via di a so capacità di pruduce diversi metaboliti secundarii cum'è l'avermectin, u cumpostu principali di l'ivermectin è a bleomicina è i so derivati, utilizati medicinali com'è agenti anticanceru21,22. In listessu modu, una varietà di cumposti erbicidi sò stati scuperti da l'actinomycetes, alcuni di i quali sò digià utilizati cummerciale1,23. Dunque, l'analisi di metaboliti actinomiceti per isolà i prudutti naturali cù l'attività biologica desiderata hè cunsiderata una strategia efficace. In questu studiu, avemu scupertu un novu compostu, cumamonamide, da S. werraensis è hà sintetizatu successu. L'acidu ursonicu hè un intermediu sinteticu di urbenamide è i so derivati. Puderà pruvucà un curling radicali caratteristicu, mostra una attività erbicida da moderata à forte, è dannu direttamente o indirettamente i microtubuli di a pianta. Tuttavia, u mecanismu d'azzione di l'acidu urmotonicu pò differisce da quellu di l'inhibitori di i microtubuli esistenti, postu chì KAND 11 disturba ancu i filamenti di l'actina è causa a morte di e cellule, suggerendu un mecanismu regulatore da quale l'acidu urmotonicu è i so derivati influenzanu una larga gamma di strutture citoscheletali. .
Una carattarizazione più dettagliata di l'acidu urbenonicu aiuterà à capisce megliu u mecanismu di l'azzione di l'acidu urbenonicu. In particulare, u prossimu scopu hè di valutà a capacità di l'acidu ursonicu per ligà à i microtubuli ridotti per determinà se l'acidu ursonicu è i so derivati agiscenu direttamente nantu à i microtubuli è li depolimerizeghjanu, o s'ellu a so azzione risulta in a desestabilizazione di i microtubuli. Inoltre, in u casu induve i microtubuli ùn sò micca un mira direttu, l'identificazione di u situ di l'azzione è l'obbiettivi molecolari di l'acidu ursonicu nantu à e cellule di a pianta aiuterà più à capiscenu e proprietà di cumposti cunnessi è pussibuli modi per migliurà l'attività erbicida. U nostru esame di bioattività hà revelatu a capacità citotossica unica di l'acidu ursonicu nantu à u crescita di e piante cum'è Arabidopsis thaliana, tabacco è liverwort, mentri nè E. coli nè e cellule HeLa sò stati affettati. A poca o nimu toxicità à e cellule animali hè un vantaghju di i derivati di l'acidu ursonicu si sò sviluppati com'è erbicidi per l'usu in campi agriculi aperti. Infatti, postu chì i microtubuli sò strutture cumuni in eucarioti, a so inibizione selettiva in e piante hè un requisitu chjave per l'erbicidi. Per esempiu, a propyzamide, un agentu depolimerizzante di i microtubuli chì si unisce direttamente à a tubulina è impedisce a polimerizazione, hè utilizatu com'è erbicida per via di a so bassa toxicità à e cellule animali24. In cuntrastu à a disopiramida, i benzamidi cunnessi anu diverse specificità di destinazione. In più di i microtubuli di a pianta, RH-4032 o benzoxamide inibisce ancu i microtubuli di cellule animali o oomiceti, rispettivamente, è a zalilamide hè usata com'è fungicida per via di a so fitotossicità bassa25,26,27. L'orsu novu scupertu è i so derivati mostranu una citotossicità selettiva contr'à e piante, ma vale a pena nutà chì e mudificazioni supplementari ponu alterà a so specificità di destinazione, potenzialmente furnisce derivati supplementari per u cuntrollu di fungi patogeni o oomiceti.
I pruprietà unichi di l'acidu urbenonicu è i so derivati sò utili per u so sviluppu cum'è erbicidi è l'utilizanu com'è strumenti di ricerca. L'impurtanza di u citoscheletru in u cuntrollu di a forma di e cellule vegetali hè largamente ricunnisciuta. Studi precedenti anu dimustratu chì e piante anu evolutu meccanismi cumplessi di l'urganizazione di i microtubuli corticali cuntrullendu a dinamica di i microtubuli per cuntrullà bè a morfogenesi. Un gran numaru di molécule rispunsevuli di a regulazione di l'attività di i microtubuli sò stati identificati, è a ricerca in relazione hè sempre in corso3,4,28. A nostra cunniscenza attuale di a dinamica di i microtubuli in e cellule vegetali ùn spiega micca cumplettamente i miccanismi di l'urganizazione di i microtubuli corticali. Per esempiu, ancu s'è a disopiramida è l'orizalina ponu depolimerizà i microtubuli, a disopiramide provoca una distorsione radicale severa mentre l'orizalina hà un effettu relativamente moderatu. Inoltre, mutazioni in a tubulina, chì stabilizza i microtubuli, causanu ancu destrorotazione in e radiche, mentri paclitaxel, chì stabilizza ancu a dinamica di i microtubuli, ùn hè micca. Dunque, studià è identificà i miri molecolari di l'acidu ursolicu duverebbe furnisce novi insights in a regulazione di i microtubuli corticali vegetali. In listessu modu, paraguni futuri di sustanzi chimichi chì sò efficaci à prumove a crescita distorta, cum'è disopyramide, è chimichi menu efficaci, cum'è l'oryzalin o l'acidu kumamotoricu, furnisceranu indizi di cumu si sviluppa a crescita distorta.
Per d 'altra banda, i riarrangiamenti citoscheletali di difesa sò una altra pussibilità per spiegà a citotossicità di l'acidu ursonicu. L'infezzione di un patogenu o l'intruduzione di un elicitore in e cellule di a pianta provoca qualchì volta a distruzzione di u citoscheletru è a morte di e cellule sussegwenti29. Per esempiu, a criptoxantina derivata da l'oomiceti hè stata rappurtata per disturbà i microtubuli è i filamenti di actina prima di a morte di e cellule di tabacco, simile à ciò chì succede cù u trattamentu KAND30,31. E similitudini trà e risposti di difesa è e risposti cellulari indotti da l'acidu ursonicu ci anu purtatu à l'ipotesi chì attivanu prucessi cellulari cumuni, anche se un effettu più veloce è più forte di l'acidu ursonicu chì a criptoxantina hè evidenti. Tuttavia, i studii anu dimustratu chì a disrupzione di i filamenti di l'actina prumove a morte di e cellule spontanee, chì ùn hè micca sempre accumpagnata da a disrupzione di i microtubuli29. Inoltre, resta à vede s'ellu sia u patogenu o l'elicitore provoca una crescita di radica distorta, cum'è i derivati di l'acidu ursonicu. Cusì, a cunniscenza moleculare chì liganu e risposte di difesa è u citoscheletru hè un prublema attraente per esse trattatu. Sfruttendu a prisenza di cumposti di pisu molekulari bassu ligati à l'acidu ursonicu, è ancu di una gamma di derivati cù putenziali variate, ponu furnisce l'opportunità di mira à i meccanismi cellulari scunnisciuti.
Inseme, a scuperta è l'applicazione di novi composti chì modulanu a dinamica di i microtubuli furnisceranu metudi putenti per affruntà i meccanismi molecolari cumplessi sottostanti a determinazione di a forma di e cellule vegetali. In questu cuntestu, l'acidu urmotonicu compostu recentemente sviluppatu, chì affetta i microtubuli è i filamenti di l'actina è induce a morte cellulare, pò furnisce l'uppurtunità di decifrare a cunnessione trà u cuntrollu di i microtubuli è questi altri miccanismi. Cusì, l'analisi chimica è biologica chì utilizanu l'acidu urbenonicu ci aiuterà à capisce i miccanismi di regulazione moleculare chì cuntrullanu u citoscheletru di a pianta.
Inoculate S. werraensis MK493-CF1 in un fiasco Erlenmeyer baffled da 500 mL chì cuntene 110 mL di mediu di sementa custituitu da 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) cumpusizioni Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) extracte di granu (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 è 0.2% CaCO3 in acqua deionized. (pH 7,4 prima di sterilizazione). I culturi di sementi sò stati incubati nantu à un agitatore rotativu (180 rpm) à 27 ° C per 2 ghjorni. Cultivazione di pruduzzione per via di fermentazione à u solidu. A cultura di sementi (7 ml) hè stata trasferita in un flask K-1 500 ml chì cuntene 40 g di mediu di pruduzzione custituitu da 15 g d'orzu pressatu (MUSO Co., Ltd., Giappone) è 25 g d'acqua deionizzata (pH micca aghjustatu prima di sterilizazione). ). A fermentazione hè stata fatta à 30 ° C in u bughju per 14 ghjorni. U materiale di fermentazione hè stata estratta cù 40 ml / bottiglia EtOH è centrifugata (1500 g, 4 ° C, 10 min). U supernatante di cultura (60 ml) hè stata estratta cù una mistura di 10% MeOH/EtOAc. A strata organica hè stata evaporata sottu pressione ridutta per ottene un residuu (59,5 mg), chì hè statu sottumessu à HPLC cun gradiente d'eluzione (0–10 minuti: 90%) nantu à una colonna in fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lunghezza 250 mm) H20–3 CN: 90–3 CN: 90% min. H2O/CH3CN à 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35-45 minuti: 90% H2O/EtOH, 45-155 minuti: 90% H2O/EtOH à 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155-200 min: 100% EtOH/EtOH, 155-200 min. 36,0 mg) hè stata isolata cum'è un polveru amorfu biancu.
Kumamotoamide (1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valore calculatu: 141,0659, valore misuratu: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603–1593, 1537 cm
Seeds Columbia (Col-0) sò stati ottenuti da u Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) cù permessu per l'usu di ricerca. I sementi di Col-0 sò stati propagati è mantinuti in i nostri cundizioni di u laboratoriu è usati cum'è e piante d'Arabidopsis salvatiche. I graneddi di Arabidopsis sò stati sterilizzati in superficia è cultivati in un mediu Murashige è Skoog à mità di forza chì cuntene 2% di saccarosi (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w / v) 2-(4-morpholino) acidu ethanesulfonic (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) è 1,5% di agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, à 23 ° C è luce constante. I Seeds of the phs1-1 mutant sò stati furniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
I Seeds of strain SR-1 sò stati furniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) è usati cum'è e piante di tabacco salvaticu. I graneddi di tabacco sò stati sterilizzati in superficia è imbevuti in acqua sterile per trè nuttati per prumove a germinazione, poi posti in una soluzione di mezza forza chì cuntene 2% saccharose, 0,05% (w / v) MES, è 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. è Skoog medium) cù pH 5,7 è incubatu à 23 ° C sottu luce constante.
Strain Tak-1 hè stata furnita da T. Kohchi (Università di Kyoto) è hè stata utilizata com'è unità sperimentale standard per u studiu di liverwort. Gemma hè stata ottenuta da e piante cultivate sterilizzate è poi placata nantu à u mediu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) chì cuntene 1% di saccharose è 0,3% di gomma di gellan è incubata à 23 ° C sottu luce cuntinua.
I celi di tabacco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) sò stati furniti da S. Hasezawa (Università di Tokyo). I celluli BY-2 sò stati diluiti 95 volte in u mediu Linsmeier è Skoog mudificatu è supplementati à settimana cù l'acidu 2,4-diclorophenoxyacetic 32. La suspension cellulaire a été mélangée à un agitateur rotatif à 130 rpm à 27 °C à l'obscurité. Lavate i celluli cù 10 volte u voluminu di mediu frescu è resuspende in u stessu mediu. E linee di cellule transgeniche BY-2 chì esprimenu in modu stabile u marcatore di microtubuli TagRFP-TUA6 o u marcatore di filamentu di actina GFP-ABD2 sottu u promotore 35S di virus di mosaicu di cavolfiore sò state generate cum'è descrittu33,34,35. Queste linee di cellula ponu esse mantinute è sincronizate cù prucessi simili à quelli usati per a linea cellulare originale BY-2.
Le cellule HeLa sono state coltivate nel mezzo di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 1,2 U/ml di penicillina e 1,2 μg/ml di streptomicina in un incubatore a 37 °C con 5% di CO2.
Tutti l'esperimenti descritti in stu manuscrittu sò stati realizati in cunfurmità cù e regule è e linee di biosicurezza giapponese.
I composti sò stati dissolti in dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) cum'è solu suluzione è diluiti in MS medium per Arabidopsis è tabacco o Gamborg B5 medium per liverwort. Per l'analisi di l'inibizione di a crescita di e radiche, più di 10 sementi per piastra sò stati suminati nantu à un mediu agar chì cuntene i composti indicati o DMSO. I Seeds sò stati incubati in una camara di crescita per 7 ghjorni. I piantini sò stati fotografiati è a durata di e radiche hè stata misurata. Per l'analisi di germinazione di Arabidopsis, 48 sementi per piastra sò stati seminati nantu à un mediu agar chì cuntene compostu 200 μM o DMSO. I graneddi di Arabidopsis sò stati cultivati in una camara di crescita è u numaru di piantini germinati hè statu cuntatu 7 ghjorni dopu a germinazione (dag). Per l'analisi di a germinazione di u tabacco, 24 sementi per piastra sò stati suminati nantu à un mediu agar chì cuntene 200 μM KAND o DMSO. I sementi di tabacco sò cultivati in una camara di crescita è u numaru di piantini germinati hè stata cuntata dopu à 14 ghjorni. Per l'analisi di l'inibizione di a crescita di liverwort, 9 embrioni da ogni piastra sò stati placcati nantu à un mediu agar chì cuntene a concentrazione indicata di KAND o DMSO è incubati in una camera di crescita per 14 ghjorni.
Aduprate piantini macchiati cù 5 mg / ml di ioduru di propidium (PI) per visualizà l'urganizazione di meristemi radicali. I signali PI sò stati osservati da a microscopia di fluorescenza utilizendu un microscopiu di scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
La coloration istochimique des racines avec β-glucuronidase (GUS) a été effectuée selon le protocole décrit par Malami et Benfey36. I piantini sò stati fissi in 90% acetone per a notte, macchiati cù 0,5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid in GUS buffer per 1 ora è pusatu in una suluzione di chloraldehyde idratata. (8 g chloral hydrate, 2 ml acqua è 1 ml glycerol) è osservatu da microscopia di cuntrastu di interferenza differenziale cù un microscopiu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
L'anguli radicali sò stati misurati nantu à e piantini di 7 ghjorni cultivati nantu à platti posti verticalmente. Misura l'angolo di a radica da a direzzione di u vettore di gravità cum'è descrittu in u passu 6.
L'arrangiamentu di i microtubuli corticale hè statu osservatu cum'è descrittu, cù mudificazioni minori à u protocolu 37. L'anticorpi anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) è Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) sò stati usati cum'è anticorpi primari è secundarii à 1: 1000 è 1: 100 diluzioni, rispettivamente. L'imaghjini di fluorescenza sò stati acquistati cù un microscopiu di scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Acquisite l'imaghjini Z-stack è creanu proiezioni di intensità massima secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
L'analisi di proliferazione di cellule HeLa hè stata realizata utilizendu Cell Counting Kit 8 (Dojindo) secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
A crescita di E. coli DH5α hè stata analizata per mezu di a densità di cellula in cultura cù un spettrofotometru à 600 nm (OD600).
L'urganizazione citoscheletrica in e cellule transgeniche BY-2 hè stata osservata utilizendu un microscopiu di fluorescenza equipatu cù un dispositivu di scanning confocal CSU-X1 (Yokogawa) è una camera sCMOS (Zyla, Andor Technology). A densità citoscheletrica hè stata valutata da l'analisi di l'imaghjini, chì quantificava a percentuale di pixel citoscheletali trà i pixel citoplasmatici in l'imaghjini confocali utilizendu u software ImageJ cum'è descrittu38,39.
Per detectà a morte di e cellule in e cellule BY-2, una aliquota di a sospensjoni cellulare hè stata incubata cù 0,05% Evans blue per 10 minuti à a temperatura di l'ambienti. La colorazione selettiva di Evans blu di e cellule morte dipende da estrusione di colorante da cellule vitali da parte della membrana plasmatica intatta40. E cellule macchiate sò state osservate cù un microscopiu di campu luminoso (BX53, Olympus).
E cellule HeLa sò cultivate in DMEM supplementatu cù 10% FBS in un incubatore umidificatu à 37 ° C è 5% CO2. E cellule sò state trattate cù 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), o 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) per 6 h à 37 ° C. E cellule sò state fissate cù MetOH per 10 min è dopu cù acetate per 5 min à a temperatura di l'ambienti. I celi fissi sò stati incubati cù l'anticorpu primariu β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluitu in 0.5% BSA / PBS per 2 ore, lavatu 3 volte cù TBST, è poi incubatu cù Alexa Fluor capra anticorpu. 488 1 ora. – Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) è 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diluitu in 0,5% BSA/PBS. Dopu avè lavatu cù TBST trè volte, e cellule macchiate sò state osservate nantu à un microscopiu invertitu Nikon Eclipse Ti-E. L'imaghjini sò stati catturati cù una camera CCD Hamamatsu ORCA-R2 raffreddata cù u software MetaMorph (Dispositivi Moleculari).
Tempu di post: 17-ghjugnu-2024