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A scuperta è l'usu beneficu di i prudutti naturali pò aiutà à migliurà a vita umana.I sustanzi chimichi inhibitori di a crescita di e piante sò largamente usati com'è erbicidi per cuntrullà e erbacce.A causa di a necessità di utilizà diversi tipi di erbicidi, ci hè bisognu di identificà cumposti cù novi miccanismi d'azzione.In questu studiu, avemu scupertu un novu compostu N -alkoxypyrrole, cumamonamide, da Streptomyces werraensis MK493-CF1 è stabilitu u prucessu di sintesi cumpletu.Attraversu analisi di attività biologica, avemu scupertu chì l'acidu urs-monoamic hè un intermediariu sinteticu di urs-monoamide è un putenziale.inhibitore di crescita di e piante.Inoltre, avemu sviluppatu diversi derivati di l'acidu urbenonicu, cumpresu u derivativu urbenyloxy (UDA), chì hà una alta attività erbicida senza affettà negativamente a crescita di e cellule HeLa.Avemu trovu ancu chì i derivati di l'acidu urmotonicu disturbanu i microtubuli di a pianta;in più, KAND affetta i filamenti di actina è induce a morte cellulare;Questi effetti multifaceted differ da quelli di l'inhibitori microtubuli cunnisciuti è suggerenu un novu mecanismu d'azzione per l'acidu ursonicu, chì rapprisenta un vantaghju impurtante in u sviluppu di novi erbicidi.
A scuperta è l'applicazione pratica di i prudutti naturali benifichi è i so derivati hè un mezzu per migliurà a qualità di a vita umana.I metaboliti secundarii pruduciuti da i microorganismi, i pianti è l'insetti anu purtatu à grandi progressi in a medicina è l'agricultura.Parechji antibiotici è droghe anti-leucemia sò stati sviluppati da i prudutti naturali.Inoltre, diversi tipi dipesticidi, fungicidi è erbicidi sò estratti da questi prudutti naturali per l'usu in l'agricultura.In particulare, l'erbicidi di cuntrollu di erbaccia sò arnesi impurtanti per aumentà a pruduzzioni di culturi in l'agricultura muderna, è parechji tipi di cumposti sò digià utilizati cummerciale.Diversi prucessi cellulari in e piante, cum'è a fotosintesi, u metabolismu di l'aminoacidu, a sintesi di u muru cellulare, a regulazione di a mitosi, a signalazione di fitohormone, o a sintesi di prutezione, sò cunsiderate target tipici di l'erbicidi.I composti chì inibiscenu a funzione di i microtubuli sò una classa cumuni di erbicidi chì affettanu a crescita di e piante affettendu a regulazione mitotica2.
I microtubuli sò cumpunenti di u citoscheletru è sò largamente conservati in e cellule eucariote.L'eterodimero di tubulina consiste di α-tubulina e β-tubulina che formano protofilamenti di microtubuli lineari, con 13 protofilamenti che formano una struttura cilindrica.I microtubuli ghjucanu parechji roli in e cellule vegetali, cumprese a determinazione di a forma di e cellule, a divisione cellulare è u trasportu intracellulare3,4.E cellule vegetali cuntenenu microtubuli sottu à a membrana di plasma di l'interfase, è questi chjamati microtubuli corticali sò pensati per cuntrullà l'urganizazione di microfibri di cellulosa per mezu di a regulazione di complexi di cellulosa sintasi4,5.I microtubuli corticale di e cellule epidermiche radicali, prisenti in a zona di allungamentu rapidu di a punta di a radica, sò situati lateralmente, è e microfibres di cellulosa seguenu sti microtubuli è limitanu a direzzione di l'espansione di e cellule, favurendu cusì l'allungamentu anisotropicu di e cellule.Dunque, a funzione di i microtubuli hè strettamente ligata à a morfologia di a pianta.Sustituzioni di l'aminoacidi in i geni chì codificanu a tubulina causanu skew di l'arrays di microtubuli corticali è a crescita à a manca o à a diritta in Arabidopsis 6,7.In listessu modu, mutazioni in e proteine associate à i microtubuli chì regulanu a dinamica di i microtubuli ponu ancu purtà à a crescita di e radici distorte8,9,10,11,12,13.Inoltre, u trattamentu cù l'erbicidi chì interferiscenu cù i microtubuli, cum'è a disopiramide, ancu cunnisciutu com'è pretilachloru, pruvucarà ancu a crescita di a radica obliqua di a sinistra14.Questi dati indicanu chì a regulazione precisa di a funzione di i microtubuli hè critica per a determinazione di a direzzione di a crescita di e piante.
Diversi tipi d'inhibitori di microtubuli sò stati scuperti, è questi droghe anu fattu cuntributi significativi à a ricerca citoscheletrica, è ancu à l'agricultura è a medicina2.In particulare, l'oryzalin, i cumposti di dinitroaniline, a disopiramide, i composti di benzamide, è i so analoghi ponu inibisce a funzione di i microtubuli è cusì impediscenu a crescita di e piante.Per quessa, sò largamente usati com'è erbicidi.Tuttavia, postu chì i microtubuli sò un cumpunente impurtante di e cellule vegetali è animali, a maiò parte di l'inibitori di i microtubuli sò citotossichi per i dui tipi di cellule.Dunque, malgradu a so utilità ricunnisciuta cum'è erbicidi, un numeru limitatu di agenti antimicrotubuli sò usati per scopi pratichi.
Streptomyces hè un genus di a famiglia Streptomyces, chì include battìri aerobichi, gram-positivi, filamentosi è hè largamente cunnisciutu per a so capacità di pruduce una larga gamma di metaboliti secundari.Per quessa, hè cunsideratu una di e fonti più impurtanti di novi prudutti naturali biologicamente attivi.In u studiu attuale, avemu scupertu un novu compostu chjamatu cumamonamide, chì hè stata isolata da Streptomyces werraensis MK493-CF1 è S. werraensis ISP 5486. Utilizendu l'analisi spettrali è l'analisi spettrali cumpletu, a struttura di cumamonamide hè stata carattarizata è u so scheletru unicu N-alkoxypyrrole. era determinatu.sintesi.L'acidu ursmonicu, un intermediu sinteticu di l'ursmonoamide è i so derivati, hè stata trovata per inibisce a crescita è a germinazione di a pianta populari Arabidopsis thaliana.In un studiu di relazione struttura-attività, truvamu chì un compostu cù C9 mudificatu à l'acidu ursonicu, chjamatu nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), aumenta significativamente l'effettu inhibitori nantu à a crescita è a germinazione.In particulare, l'inhibitore di a crescita di a pianta di novu scupertu hà ancu affettatu a crescita di tabacco è liverwort è ùn era micca citotossicu per i batteri o e cellule HeLa.Inoltre, certi derivati di l'acidu urmotonicu inducenu un fenotipu radicali distortu, chì implica chì sti derivati affettanu direttamente o indirettamente i microtubuli.In cunfurmità cù questa idea, e nostre osservazioni di i microtubuli marcati sia immunoistochimicamente sia cù proteine fluorescenti indicanu chì u trattamentu KAND depolimerizza i microtubuli.Inoltre, u trattamentu cù derivati di l'acidu kumamotonic disrupted microfilaments actin.Cusì, avemu scupertu un novu inhibitore di a crescita di a pianta chì u so mecanismu unicu d'azzione implica a distruzzione di u citoscheletru.
A ceppa MK493-CF1 hè stata isolata da a terra in Shinagawa-ku, Tokyo.A ceppa MK493-CF1 hà furmatu miceliu stromal ben ramificato.A sequenza parziale di u genu di RNA ribosomali 16S (1422 bp) hè stata determinata.Stu strain hè assai simili à S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: strain tipicu, 99,93%).Basatu annantu à stu risultatu, hè statu determinatu chì sta ceppa era strettamente ligata à u tipu di ceppa di S. werraensis.Per quessa, avemu pruvisoriamente chjamatu sta ceppa S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T pruduce ancu i stessi composti bioattivi.Siccomu ci era pocu prima ricerca per ottene prudutti naturali da stu microorganismu, più ricerca chimica hè stata realizata.Dopu à u cultivo di S. werraensis MK493-CF1 nantu à u mediu d'orzu da a fermentazione solidu à 30 ° C per 14 ghjorni, u mediu hè stata estratta cù 50% EtOH.60 ml di mostra hè stata secca per ottene 59,5 mg di extracte crudo.L'estrattu crudu hè statu sottumessu à HPLC in fase inversa per dà N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, chjamatu cumamonamide, 36,0 mg).A quantità tutale di 1 hè circa 60% di l'estrattu crudu.Dunque, avemu decisu di studià in dettaglio e proprietà di kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 hè un pezzu amorfu biancu è spettrometria di massa d'alta risoluzione (HRESIMS) cunfirma C6H8N2O2 (Fig. 1).U frammentu di pirroli C2-sustituitu di stu compostu hè carattarizatu da δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH in spettru 1H RMN: 4,5 Hz). , H-5) è δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), è u spettru 13C NMR mostra a prisenza di quattru atomi di carbonu sp2.A prisenza di un gruppu amide in a pusizione C2 hè stata valutata da a correlazione HMBC da u protone C-3 à u carbonile amide carbonyl à δC 161.1.Inoltre, i picchi di 1 H è 13 C RMN à δH 4.10 (3H, S) è δC 68.3 indicanu a presenza di gruppi N-metossi in a molécula.Ancu s'è a pusizione curretta di u gruppu metossi ùn era micca stata determinata cù l'analisi spettroscòpica cum'è a spettroscopia di differenza rinfurzata è l'abbreviazione nucleare Overhauser (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide diventò u primu compostu candidatu.
Per determinà a struttura curretta di 1, una sintesi tutale hè stata realizata (Fig. 2a).U trattamentu di 2-aminopyridine 2 dispunibule in u cummerciu cù m-CPBA hà risultatu in u N-oxide 3 currispundente in u rendiment quantitatiu.Dopu à a 2-aminoazidation di 2, a reazione di ciclocondensazione descritta da Abramovich hè stata realizata in benzene à 90 ° C per ottene u 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile desideratu 5 in grammi.Velocità 60% (duie tappe).15,16.A metilazione è l'idrolisi di 4 hà datu l'acidu 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic (chjamatu "cumotonic acid", 6) in bonu rendiment (70%, dui passi).Infine, l'amidazione via l'intermediatu di cloruru d'acidu 6 cù l'ammonia acquosa hà datu l'amida di Kumamoto 1 in un rendimentu di 98%.Tutti i dati spettrali di sintesi 1 eranu simili à isolati 1, cusì a struttura di 1 hè stata determinata;
Sintesi generale è analisi di l'attività biologica di l'urbenamide è l'acidu urbenic.(a) Sintesi totale di Kumamoto amide.(b) I piantini di Arabidopsis Columbia (Col) di tipu salvaticu di sette ghjorni sò stati cultivati nantu à i platti Murashige è Skoog (MS) chì cuntenenu cumamonamide 6 o cumamonamide 1 à a cuncentrazione indicata.Scala bar = 1 cm.
Prima, avemu evaluatu l'attività biologica di l'urbenamide è i so intermedii per a so capacità di modulà a crescita di e piante.Avemu aghjustatu diverse concentrazioni di ursmonamide 1 o l'acidu ursmonicu 6 à MS agar medium è cultivate piantini di Arabidopsis thaliana nantu à questu mediu.Questi saggi anu dimustratu chì e cuncintrazioni elevate (500 μM) di 6 inhibited root growth (Fig. 2b).In seguitu, avemu generatu diversi derivati sustituendu a pusizione N1 di 6 è eseguite studii di relazione struttura-attività nantu à elli (u prucessu di sintesi analogica hè descritta in l'Informazione di Supportu (SI)).I piantini di Arabidopsis sò stati cultivati nantu à un mediu chì cuntene 50 μM derivati di l'acidu ursonicu, è a lunghezza di a radica hè stata misurata.cum'è mostra nantu à a stampa.Cum'è mostra in Figure 3a, b, è S1, l'acidi cumamo anu diverse lunghezze di catene alcossi lineari (9, 10, 11, 12 è 13) o catene alcossi grandi (15, 16 è 17) à a pusizione N1.I derivati anu dimustratu una inhibizione significativa di a crescita radicali.Inoltre, avemu truvatu chì l'applicazione di 200 μM 10, 11, o 17 hà impeditu a germinazione (Figs. 3c è S2).
Studiu di a relazione struttura-attività di Kumamoto amide è composti rilativi.(a) Struttura è schema di sintesi di analoghi.(b) Quantificazione di a lunghezza di a radica di piantini di 7 ghjorni cultivati in MS medium cù o senza derivati cumamonamide 50 μM.L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05).n>18. I dati sò indicati cum'è media ± SD.nt significa "micca pruvatu" perchè più di 50% di e sementi ùn anu micca germinatu.(c) Quantificazione di a rata di germinazione di e sementi trattati incubati per 7 ghjorni in MS medium cù o senza 200 μM cumamonamide è composti rilativi.L'asterischi indicanu differenzi significati cù u trattamentu simulatu (test chi-square).n = 96.
Curiosamente, l'aghjunzione di catene laterali alchili più longu di C9 hà riduciutu l'attività inibitoria, suggerenu chì i composti di l'acidu kumamotoic necessitanu catene laterali di una certa dimensione per esibisce a so attività biologica.
Perchè l'analisi di a relazione struttura-attività hà dimustratu chì C9 hè statu mudificatu à l'acidu ursonicu è u derivatu nonyloxy di l'acidu ursonicu (in seguitu chjamatu KAND 11) era l'inhibitore di a crescita di a pianta più efficace, avemu realizatu una caracterizazione più detallata di KAND 11. Trattamentu di Arabidopsis cù 50 μM KAND 11 quasi completamente impeditu a germinazione, mentri cuncintrazioni più bassu (40, 30, 20, o 10 μM) di KAND 11 inhibited root growth in a dose-dependent manera (Fig. 4a, b).Per pruvà se KAND 11 affetta a viabilità di i meristemi radicali, avemu esaminatu i meristemi radicali macchiati cù ioduru di propidium (PI) è misurate a dimensione di l'area di meristemi.A dimensione di u meristemu di e piantini cultivati nantu à un mediu chì cuntene 25 μM KAND-11 era 151.1 ± 32.5 μm, mentri a dimensione di u meristemu di e piantini cultivati nantu à un mediu di cuntrollu chì cuntene DMSO era 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d) , chì indica chì KAND-11 restaura l'attività cellulare.sparghje.Meristema radice.In cunfurmità cù questu, u trattamentu KAND 11 hà riduciutu a quantità di u marcatu di divisione cellula CDKB2; 1p::CDKB2; 1-GUS signal in u meristemu radicali (Fig. 4e) 17 .Questi risultati indicanu chì KAND 11 inibisce a crescita di e radici riducendu l'attività di proliferazione cellulare.
Analisi di l'effettu inhibitori di i derivati di l'acidu urbenonicu (derivati urbenyloxy) nantu à a crescita.(a) Seedlings di Col salvaticu di 7 ghjorni cultivati nantu à i platti MS cù a cuncentrazione indicata di KAND 11. Scale bar = 1 cm.(b) Quantificazione di a lunghezza di a radica.E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05).n>16. I dati sò indicati cum'è media ± SD.(c) Microscopia Confocal di iodudu di propidium-stained-tipu salvaticu Col razzi cultivati nantu à i platti MS cù o senza 25 μM KAND 11. I brackets bianchi indicanu meristema di a radica.Barre d'échelle = 100 µm.(d) Quantificazione di a dimensione di u meristemu radicali (n = 10 à 11).E differenze statistiche sò state determinate cù u test t (p< 0,05).I bars rapprisentanu a dimensione media di meristema.(e) Microscopia di cuntrastu d'interferenza differenziale (DIC) di un meristemu radicali chì cuntene u custruttu CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS macchiatu è macchiatu nantu à piantini di 5 ghjorni cultivati nantu à piastre MS cù o senza test KAND 25 µM.
A fitotossicità di KAND 11 hè stata ulteriormente testata cù una altra pianta dicotiledona, tabacco (Nicotiana tabacum), è un urganismu maiò di u mudellu di pianta di terra, liverwort (Marchantia polymorpha).Cum'è in u casu di Arabidopsis, e piantini di tabacco SR-1 cultivate nantu à u mediu chì cuntene 25 μM KAND 11 pruducia razzi più brevi (Fig. 5a).Inoltre, 40 di 48 sementi germinati nantu à platti chì cuntenenu 200 μM KAND 11, mentre chì tutti i 48 sementi germinavanu nantu à i media trattati cù simulazione, chì indicanu chì concentrazioni più elevate di KAND eranu significative (p< 0,05;chi test -square) hà impeditu a germinazione di u tabacco.(Fig. 5b).Inoltre, a cuncentrazione di KAND 11 chì inibisce a crescita bacteriana in liverwort era simili à a cuncentrazione efficace in Arabidopsis (Fig. 5c).Questi risultati indicanu chì KAND 11 pò impedisce a crescita di una varietà di piante.Dopu avemu investigatu a pussibuli citotossicità di i composti di l'orsu monoamide in altri organismi, vale à dì e cellule HeLa umane è Escherichia coli ceppa DH5α, cum'è rapprisentanti di cellule animali è batteriche superiore, rispettivamente.In una seria di test di proliferazione cellulare, avemu osservatu chì cumamonamide 1, cumamonamidic acid 6 è KAND 11 ùn anu micca affettatu u crescita di e cellule HeLa o E. coli à cuncentrazione di 100 μM (Fig. 5d, e).
Inibizione di crescita di KAND 11 in organismi non-Arabidopsis.(a) I piantini di tabacco SR-1 di tipu salvaticu di duie settimane sò stati cultivati nantu à platti MS posizionati verticalmente chì cuntenenu 25 μM KAND 11. (b) I piantini di tabacco SR-1 di tipu salvaticu di duie settimane sò stati cultivati nantu à posizionamentu horizontale. Piastre MS chì cuntenenu 200 μM KAND 11. (c) Ciumi di liverwort Tak-1 di tipu salvaticu di duie settimane cultivati nantu à i platti Gamborg B5 cù a concentrazione indicata di KAND 11. E frecce rosse indicanu spori chì anu cessatu di crescenu in l'incubazione di duie settimane. periodu.(d) Test di proliferazione cellulare di cellule HeLa.U nùmeru di cellule viable hè stata misurata à intervalli di tempu fissi utilizendu un kit di cuntazione di cellule 8 (Dojindo).Comu cuntrollu, e cellule HeLa sò state trattate cù 5 μg/ml actinomicina D (Act D), chì inibisce a trascrizione di RNA polimerasi è provoca a morte cellulare.L'analisi sò state realizate in triplicate.(e) Test di proliferazione cellulare di E. coli.A crescita di E. coli hè stata analizata per mezu di OD600.Comu cuntrollu, e cellule sò state trattate cù 50 μg/ml ampicillin (Amp), chì inibisce a sintesi di u muru di a cellula bacteriana.L'analisi sò state realizate in triplicate.
Per decifrare u miccanisimu di l'azzione di a citotossicità causata da i cumposti ligati à l'uramide, avemu rianalizzatu i derivati di l'acidu urbenic cù effetti inhibitori moderati.cum'è mostra nantu à a stampa.Comme le montrent les figures 2b, 6a, les plantules cultivées sur plaques d'agar contenant de fortes concentrations (200 μM) d'acide urmotonique 6 produisaient des racines plus courtes et courbées à gauche (θ = – 23.7 ± 6.1), tandis que les plantules cultivées sur le milieu de contrôle, le e piantini pruducianu razzi quasi dritti (θ = – 3,8 ± 7,1).Questa crescita obliqua caratteristica hè cunnisciuta per esse risultatu da a disfunzione di i microtubuli corticali14,18.In cunfurmità cù questa scuperta, a droga di disopiramida è l'oryzalin disstabilizzanti di i microtubuli inducevanu una inclinazione di a radica simile in i nostri cundizioni di crescita (Figs. 2b, 6a).À u listessu tempu, avemu pruvatu i derivati di l'acidu urmotonicu è selezziunate parechji di elli chì, à certe cuncentrazioni, inducevanu a crescita di e radiche oblique.I cumposti 8, 9 è 15 anu cambiatu a direzzione di a crescita radicali à 75 μM, 50 μM è 40 μM, rispettivamente, chì indicanu chì questi cumposti ponu effittivamenti destabilizà i microtubuli (Fig. 2b, 6a).Avemu ancu pruvatu u derivatu di l'acidu ursolic più putente, KAND 11, à una cuncentrazione più bassa (15 µM) è truvamu chì l'applicazione di KAND 11 inibisce a crescita di e radici è chì a direzzione di a crescita di e radici era irregolare, ancu s'ellu tendenu à pendenza à a manca ( Figura C3)..Perchè e concentrazioni più elevate di droghe destabilizzanti di i microtubuli a volte inibiscenu a crescita di e piante piuttostu chè causanu l'inclinazione di e radici, in seguitu avemu valutatu a pussibilità chì KAND 11 affetta i microtubuli osservendu i microtubuli corticali in e cellule epidermiche radicali.Immunohistochemistry cù l'anticorpi anti-β-tubulin in i celluli epidermali di e radichi di piantini trattati cù 25 μM KAND 11 hà dimustratu a scumparsa di quasi tutti i microtubuli corticale in i celluli epidermali in a zona di allungamentu (Fig. 6b).Questi risultati indicanu chì l'acidu kumamotonic è i so derivati agiscenu direttamente o indirettamente nantu à i microtubuli per disrupti è chì questi composti sò novi inhibitori di microtubuli.
L'acidu ursonicu è i so derivati alteranu i microtubuli corticali in Arabidopsis thaliana.(a) Angulu d'inclinazione radicali misuratu in presenza di diversi derivati di l'acidu urmotonicu à e cuncentrazioni indicate.L'effetti di dui composti cunnisciuti per inibisce i microtubuli: disopyramide è oryzalin sò stati ancu analizati.L'inseritu mostra u standard utilizatu per misurà l'angolo di crescita radicali.L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05).n>19. Scale bar = 1 cm.(b) Microtubuli corticali in cellule epidermiche in a zona di allungamentu.I microtubuli in e radici di Arabidopsis Col di tipu salvaticu cultivati nantu à piastre MS cù o senza 25 μM KAND 11 sò stati visualizati da colorazione immunoistochimica utilizendu anticorpi primari β-tubulina è anticorpi secundarii Alexa Fluor-conjugated.Barre d'échelle = 10 µm.(c) Struttura mitotica di i microtubuli in u meristema radicali.I microtubuli sò stati visualizati cù a tintura immunoistochimica.Strutture mitotiche, cumprese zoni di profase, spindles è phragmoplasts, sò stati cuntati da l'imaghjini cunfocali.Le frecce indicano strutture mitotiche di microtubuli.L'asterischi indicanu differenze significative cù u trattamentu simulatu (test t, p< 0,05).n>9. Scala bar = 50 µm.
Ancu Ursa hà a capacità di disturbà a funzione di i microtubuli, u so mecanismu d'azzione hè previstu per esse sfarente da l'agenti depolimerizzanti tipici di i microtubuli.Per esempiu, concentrazioni più elevate di agenti depolimerizzanti di microtubuli cum'è disopiramide è orizalina inducenu espansione anisotropica di e cellule epidermiche, mentri KAND 11 ùn hè micca.Inoltre, a co-applicazione di KAND 11 è disopyramide hà risultatu in una risposta di crescita di a radica indotta da disopiramida è l'inhibizione di a crescita inducida da KAND 11 hè stata osservata (Fig. S4).Avemu ancu analizatu a risposta di a disopiramida ipersensibile 1-1 (phs1-1) mutante à KAND 11. phs1-1 hà una mutazione di puntu di tubulin kinase non canonica è pruduce radichi più brevi quandu si tratta cù disopyramide9,20.phs1-1 mutanti muderni cultivati nantu à agar medium chì cuntenenu KAND 11 avianu radichi più brevi simili à quelli cultivati in disopyramid (fig. S5).
Inoltre, avemu osservatu strutture di microtubuli mitotichi, cum'è zoni di profase, spindles è phragmoplasts, in u meristemu radicali di e piantini trattati cù KAND 11. In cunfurmità cù l'osservazioni per CDKB2; 1p:: CDKB2; 1-GUS, una diminuzione significativa in u nùmeru di microtubuli mitoticu hè statu osservatu (Fig. .6c).
Per caratterizà a citotossicità di KAND 11 à a risoluzione subcellulare, avemu trattatu e cellule di sospensione di tabacco BY-2 cù KAND 11 è osservatu a so risposta.Prima avemu aghjustatu KAND 11 à e cellule BY-2 chì esprimenu TagRFP-TUA6, chì marca fluorescente i microtubuli, per valutà l'effettu di KAND 11 nantu à i microtubuli corticali.A densità di i microtubuli corticali hè stata valutata cù l'analisi di l'imaghjini, chì quantificava a percentuale di pixel citoscheletali trà i pixel citoplasmatici.I risultati di l'assay anu dimustratu chì dopu u trattamentu cù 50 μM o 100 μM KAND 11 per 1 ora, a densità diminuì significativamente à 0.94 ± 0.74% o 0.23 ± 0.28%, rispettivamente, mentre chì a densità di e cellule trattate cù DMSO, ammontava à ± 10. % (Fig. 7a).Questi risultati sò cunsistenti cù l'osservazione in Arabidopsis chì u trattamentu KAND 11 induce a depolimerizazione di i microtubuli corticale (Fig. 6b).Avemu ancu esaminatu a linea BY-2 cù filamenti d'actina marcati GFP-ABD dopu u trattamentu cù a stessa cuncentrazione di KAND 11 è osservatu chì u trattamentu KAND 11 hà disturbatu i filamenti d'actina.U trattamentu cù 50 μM o 100 μM KAND 11 per 1 h hà riduciutu significativamente a densità di filamenti di actina à 1.20 ± 0.62% o 0.61 ± 0.26%, rispettivamente, mentre chì a densità in cellule trattate cù DMSO era 1.69 ± 0.69% (Fig.7b).Questi risultati cuntrastanu cù l'effetti di propyzamide, chì ùn affetta micca i filamenti di actina, è di latrunculin B, un depolymerizer d'actina chì ùn affetta micca i microtubuli (SI Figura S6).Inoltre, u trattamentu cù cumamonamide 1, cumamonamide acid 6, o KAND 11 ùn hà micca affettatu i microtubuli in e cellule HeLa (SI Figura S7).Cusì, u mecanismu di l'azzione di KAND 11 hè credutu chì hè diversu da quellu di i disruptori di citoscheletru cunnisciuti.Inoltre, a nostra osservazione microscòpica di e cellule BY-2 trattate cù KAND 11 hà revelatu l'iniziu di a morte cellulare durante u trattamentu KAND 11 è hà dimustratu chì a proporzione di cellule morte di Evans blu-stained ùn hà micca aumentatu significativamente dopu à 30 min di trattamentu KAND 11, mentri dopu à 90 minuti di trattamentu cù 50 μM o 100 μM KAND, u nùmeru di caghjuli morti aumentatu à 43,7% o 80,1%, rispettivamente (Fig. 7c).Inseme, sti dati indicanu chì u novu derivatu di l'acidu ursolicu KAND 11 hè un inhibitore citoscheleticu specificu di a pianta cù un mecanismu d'azzione prima scunnisciutu.
KAND affetta i microtubuli corticali, i filamenti di actina è a viabilità di e cellule BY-2 di tabacco.(a) Visualizzazione di microtubuli corticali in cellule BY-2 in presenza di TagRFP-TUA6.Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie confocale.A densità di i microtubuli corticali hè stata calculata da micrografie di 25 cellule indipendenti.E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05).Barre d'échelle = 10 µm.(b) Filamenti di actina corticale in cellule BY-2 visualizzate in presenza di GFP-ABD2.Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie confocale.A densità di filamenti di actina corticale hè stata calculata da micrografie di 25 cellule indipendenti.E lettere indicanu differenze significative (test Tukey HSD, p< 0,05).Barre d'échelle = 10 µm.(c) Osservazione di cellule BY-2 morte da colorazione blu Evans.Les cellules BY-2 traitées avec KAND 11 (50 μM ou 100 μM) ou DMSO ont été examinées par microscopie à champ clair.n = 3.Barre d'échelle = 100 µm.
A scuperta è l'applicazione di novi prudutti naturali hà purtatu à avanzamenti significativi in parechji aspetti di a vita umana, cumpresa a medicina è l'agricultura.A ricerca storica hè stata fatta per ottene composti utili da e risorse naturali.In particulare, l'actinomycetes sò cunnisciuti per esse utili com'è antibiotici antiparassitarii per i nematodi per via di a so capacità di pruduce diversi metaboliti secundarii cum'è l'avermectin, u cumpostu principali di l'ivermectin è a bleomicina è i so derivati, utilizati medicinali com'è agenti anticanceru21,22.In listessu modu, una varietà di cumposti erbicidi sò stati scuperti da l'actinomycetes, alcuni di i quali sò digià utilizati cummerciale1,23.Dunque, l'analisi di metaboliti actinomiceti per isolà i prudutti naturali cù l'attività biologica desiderata hè cunsiderata una strategia efficace.In questu studiu, avemu scupertu un novu compostu, cumamonamide, da S. werraensis è hà sintetizatu successu.L'acidu ursonicu hè un intermediu sinteticu di urbenamide è i so derivati.Puderà pruvucà un curling radicali caratteristicu, mostra una attività erbicida da moderata à forte, è dannu direttamente o indirettamente i microtubuli di a pianta.Tuttavia, u mecanismu d'azzione di l'acidu urmotonicu pò differisce da quellu di l'inhibitori di i microtubuli esistenti, postu chì KAND 11 disturba ancu i filamenti di l'actina è causa a morte di e cellule, suggerendu un mecanismu regulatore da quale l'acidu urmotonicu è i so derivati influenzanu una larga gamma di strutture citoscheletali..
Una carattarizazione più dettagliata di l'acidu urbenonicu aiuterà à capisce megliu u mecanismu di l'azzione di l'acidu urbenonicu.In particulare, u prossimu scopu hè di valutà a capacità di l'acidu ursonicu per ligà à i microtubuli ridotti per determinà se l'acidu ursonicu è i so derivati agiscenu direttamente nantu à i microtubuli è li depolimerizeghjanu, o s'ellu a so azzione risulta in a desestabilizazione di i microtubuli.Inoltre, in u casu induve i microtubuli ùn sò micca un mira direttu, l'identificazione di u situ di l'azzione è l'obbiettivi molecolari di l'acidu ursonicu nantu à e cellule di a pianta aiuterà più à capiscenu e proprietà di cumposti cunnessi è pussibuli modi per migliurà l'attività erbicida.U nostru esame di bioattività hà revelatu a capacità citotossica unica di l'acidu ursonicu nantu à u crescita di e piante cum'è Arabidopsis thaliana, tabacco è liverwort, mentri nè E. coli nè e cellule HeLa sò stati affettati.A poca o nimu toxicità à e cellule animali hè un vantaghju di i derivati di l'acidu ursonicu si sò sviluppati com'è erbicidi per l'usu in campi agriculi aperti.Infatti, postu chì i microtubuli sò strutture cumuni in eucarioti, a so inibizione selettiva in e piante hè un requisitu chjave per l'erbicidi.Per esempiu, a propyzamide, un agentu depolimerizzante di i microtubuli chì si unisce direttamente à a tubulina è impedisce a polimerizazione, hè utilizatu com'è erbicida per via di a so bassa toxicità à e cellule animali24.In cuntrastu à a disopiramida, i benzamidi cunnessi anu diverse specificità di destinazione.In più di i microtubuli di a pianta, RH-4032 o benzoxamide inibisce ancu i microtubuli di cellule animali o oomiceti, rispettivamente, è a zalilamide hè usata com'è fungicida per via di a so fitotossicità bassa25,26,27.L'orsu novu scupertu è i so derivati mostranu una citotossicità selettiva contr'à e piante, ma vale a pena nutà chì e mudificazioni supplementari ponu alterà a so specificità di destinazione, potenzialmente furnisce derivati supplementari per u cuntrollu di fungi patogeni o oomiceti.
I pruprietà unichi di l'acidu urbenonicu è i so derivati sò utili per u so sviluppu cum'è erbicidi è l'utilizanu com'è strumenti di ricerca.L'impurtanza di u citoscheletru in u cuntrollu di a forma di e cellule vegetali hè largamente ricunnisciuta.Studi precedenti anu dimustratu chì e piante anu evolutu meccanismi cumplessi di l'urganizazione di i microtubuli corticali cuntrullendu a dinamica di i microtubuli per cuntrullà bè a morfogenesi.Un gran numaru di molécule rispunsevuli di a regulazione di l'attività di i microtubuli sò stati identificati, è a ricerca in relazione hè sempre in corso3,4,28.A nostra cunniscenza attuale di a dinamica di i microtubuli in e cellule vegetali ùn spiega micca cumplettamente i miccanismi di l'urganizazione di i microtubuli corticali.Per esempiu, ancu s'è a disopiramida è l'orizalina ponu depolimerizà i microtubuli, a disopiramide provoca una distorsione radicale severa mentre l'orizalina hà un effettu relativamente moderatu.Inoltre, mutazioni in a tubulina, chì stabilizza i microtubuli, causanu ancu destrorotazione in e radiche, mentri paclitaxel, chì stabilizza ancu a dinamica di i microtubuli, ùn hè micca.Dunque, studià è identificà i miri molecolari di l'acidu ursolicu duverebbe furnisce novi insights in a regulazione di i microtubuli corticali vegetali.In listessu modu, paraguni futuri di sustanzi chimichi chì sò efficaci à prumove a crescita distorta, cum'è disopyramide, è chimichi menu efficaci, cum'è l'oryzalin o l'acidu kumamotoricu, furnisceranu indizi di cumu si sviluppa a crescita distorta.
Per d 'altra banda, i riarrangiamenti citoscheletali di difesa sò una altra pussibilità per spiegà a citotossicità di l'acidu ursonicu.L'infezzione di un patogenu o l'intruduzione di un elicitore in e cellule di a pianta provoca qualchì volta a distruzzione di u citoscheletru è a morte di e cellule sussegwenti29.Per esempiu, a criptoxantina derivata da l'oomiceti hè stata rappurtata per disturbà i microtubuli è i filamenti di actina prima di a morte di e cellule di tabacco, simile à ciò chì succede cù u trattamentu KAND30,31.E similitudini trà e risposti di difesa è e risposti cellulari indotti da l'acidu ursonicu ci anu purtatu à l'ipotesi chì attivanu prucessi cellulari cumuni, anche se un effettu più veloce è più forte di l'acidu ursonicu chì a criptoxantina hè evidenti.Tuttavia, i studii anu dimustratu chì a disrupzione di i filamenti di l'actina prumove a morte di e cellule spontanee, chì ùn hè micca sempre accumpagnata da a disrupzione di i microtubuli29.Inoltre, resta à vede s'ellu sia u patogenu o l'elicitore provoca una crescita di radica distorta, cum'è i derivati di l'acidu ursonicu.Cusì, a cunniscenza moleculare chì liganu e risposte di difesa è u citoscheletru hè un prublema attraente per esse trattatu.Sfruttendu a prisenza di cumposti di pisu molekulari bassu ligati à l'acidu ursonicu, è ancu di una gamma di derivati cù putenziali variate, ponu furnisce l'opportunità di mira à i meccanismi cellulari scunnisciuti.
Inseme, a scuperta è l'applicazione di novi composti chì modulanu a dinamica di i microtubuli furnisceranu metudi putenti per affruntà i meccanismi molecolari cumplessi sottostanti a determinazione di a forma di e cellule vegetali.In questu cuntestu, l'acidu urmotonicu compostu recentemente sviluppatu, chì affetta i microtubuli è i filamenti di l'actina è induce a morte cellulare, pò furnisce l'uppurtunità di decifrare a cunnessione trà u cuntrollu di i microtubuli è questi altri miccanismi.Cusì, l'analisi chimica è biologica chì utilizanu l'acidu urbenonicu ci aiuterà à capisce i miccanismi di regulazione moleculare chì cuntrullanu u citoscheletru di a pianta.
Inoculare S. werraensis MK493-CF1 in un fiasco Erlenmeyer da 500 mL contenente 110 mL di mezzo di seme costituito da 2% (p/v) di galattosio, 2% (p/v) di pasta di essenza, 1% (p/v) di composizione Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) extracte di granu (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 è 0.2% CaCO3 in acqua deionized.(pH 7,4 prima di sterilizazione).I culturi di sementi sò stati incubati nantu à un agitatore rotativu (180 rpm) à 27 ° C per 2 ghjorni.Cultivazione di pruduzzione per via di fermentazione à u solidu.A cultura di sementi (7 ml) hè stata trasferita in un flask K-1 di 500 ml chì cuntene 40 g di mediu di pruduzzione custituitu da 15 g d'orzu pressatu (MUSO Co., Ltd., Giappone) è 25 g d'acqua deionizzata (pH micca aghjustatu). prima di sterilizazione).).A fermentazione hè stata fatta à 30 ° C in u bughju per 14 ghjorni.U materiale di fermentazione hè stata estratta cù 40 ml / bottiglia EtOH è centrifugata (1500 g, 4 ° C, 10 min).U supernatante di cultura (60 ml) hè stata estratta cù una mistura di 10% MeOH/EtOAc.A strata organica hè stata evaporata sottu pressione ridutta per ottene un residuu (59,5 mg), chì hè statu sottumessu à HPLC cun gradiente d'eluzione (0-10 minuti: 90%) nantu à una colonna di fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × lunghezza 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuti: 90% H2O/CH3CN à 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minuti: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuti: 90% H2O /EtOH à 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155-200 min: 100% EtOH) à un flussu di 1,5 ml / min, cumamonamide (1, 36,0 mg) hè stata isolata cum'è un polveru amorfu biancu.
Kumamotoamide (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-RMN (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valore calculatu: 141,0659, valore misuratu: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603–1593, 1537 cm
Seeds Columbia (Col-0) sò stati ottenuti da u Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) cù permessu per l'usu di ricerca.I sementi di Col-0 sò stati propagati è mantinuti in i nostri cundizioni di u laboratoriu è usati cum'è e piante d'Arabidopsis salvatiche.I sementi di Arabidopsis sò stati sterilizzati in superficia è cultivati in un mediu Murashige è Skoog à mità di forza chì cuntene 2% saccarosi (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w / v) 2-(4-morfolino) acidu etansulfonicu (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) è 1,5% di agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, à 23 ° C è luce constante.I Seeds of the phs1-1 mutant sò stati furniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
I Seeds of strain SR-1 sò stati furniti da T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) è usati cum'è e piante di tabacco salvaticu.I sementi di tabacco sò stati sterilizzati in superficia è imbevuti in acqua sterile per trè notti per prumove a germinazione, dopu posti in una soluzione di mezza forza chì cuntene 2% di saccarosi, 0,05% (w / v) MES, è 0,8% di gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.è Skoog medium) cù pH 5,7 è incubatu à 23 ° C sottu luce constante.
Strain Tak-1 hè stata furnita da T. Kohchi (Università di Kyoto) è hè stata utilizata com'è unità sperimentale standard per u studiu di liverwort.Gemma hè stata ottenuta da e piante cultivate sterilizzate è poi placata nantu à u mediu Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) chì cuntene 1% di saccharose è 0,3% di gomma di gellan è incubata à 23 ° C sottu luce cuntinua.
I celi di tabacco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) sò stati furniti da S. Hasezawa (Università di Tokyo).I celluli BY-2 sò stati diluiti 95 volte in u mediu Linsmeier è Skoog mudificatu è supplementati à settimana cù l'acidu 2,4-diclorophenoxyacetic 32.La suspension cellulaire a été mélangée à un agitateur rotatif à 130 rpm à 27 °C à l'obscurité.Lavate i celluli cù 10 volte u voluminu di mediu frescu è resuspende in u stessu mediu.E linee di cellule transgeniche BY-2 chì esprimenu in modu stabile u marcatore di microtubuli TagRFP-TUA6 o u marcatore di filamentu di actina GFP-ABD2 sottu u promotore 35S di virus di mosaicu di cavolfiore sò state generate cum'è descrittu33,34,35.Queste linee di cellula ponu esse mantinute è sincronizate cù prucessi simili à quelli usati per a linea cellulare originale BY-2.
Le cellule HeLa sono state coltivate nel mezzo di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 1,2 U/ml di penicillina e 1,2 μg/ml di streptomicina in un incubatore a 37 °C con 5% di CO2.
Tutti l'esperimenti descritti in stu manuscrittu sò stati realizati in cunfurmità cù e regule è e linee di biosicurezza giapponese.
I composti sò stati dissolti in dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) cum'è solu suluzione è diluiti in MS medium per Arabidopsis è tabacco o Gamborg B5 medium per liverwort.Per l'analisi di l'inibizione di a crescita di e radiche, più di 10 sementi per piastra sò stati suminati nantu à un mediu agar chì cuntene i composti indicati o DMSO.I Seeds sò stati incubati in una camara di crescita per 7 ghjorni.I piantini sò stati fotografiati è a durata di e radiche hè stata misurata.Per l'analisi di germinazione di Arabidopsis, 48 sementi per piastra sò stati seminati nantu à un mediu agar chì cuntene compostu 200 μM o DMSO.I graneddi d'Arabidopsis sò stati cultivati in una camara di crescita è u numaru di piantini germinati hè statu cuntatu 7 ghjorni dopu a germinazione (dag).Per l'analisi di a germinazione di u tabacco, 24 sementi per piastra sò stati suminati nantu à un mediu agar chì cuntene 200 μM KAND o DMSO.I sementi di tabacco sò cultivati in una camara di crescita è u numaru di piantini germinati hè stata cuntata dopu à 14 ghjorni.Per l'analisi di l'inibizione di a crescita di liverwort, 9 embrioni da ogni piastra sò stati placcati nantu à un mediu agar chì cuntene a concentrazione indicata di KAND o DMSO è incubati in una camera di crescita per 14 ghjorni.
Aduprate piantini macchiati cù 5 mg / ml di ioduru di propidium (PI) per visualizà l'urganizazione di meristemi radicali.I signali PI sò stati osservati da a microscopia di fluorescenza utilizendu un microscopiu di scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
La coloration istochimique des racines avec β-glucuronidase (GUS) a été effectuée selon le protocole décrit par Malami et Benfey36.I piantini sò stati fissi in 90% acetone per a notte, macchiati cù 0,5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid in GUS buffer per 1 ora è pusatu in una suluzione di chloraldehyde idratata.(8 g chloral hydrate, 2 ml acqua è 1 ml glycerol) è osservatu da microscopia di cuntrastu di interferenza differenziale cù un microscopiu Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
L'anguli radicali sò stati misurati nantu à e piantini di 7 ghjorni cultivati nantu à platti posti verticalmente.Misura l'angolo di a radica da a direzzione di u vettore di gravità cum'è descrittu in u passu 6.
L'arrangiamentu di i microtubuli corticale hè statu osservatu cum'è descrittu, cù mudificazioni minori à u protocolu 37.L'anticorpi anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) è Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) sò stati usati cum'è anticorpi primari è secundarii in diluzioni 1:1000 è 1:100, rispettivamente.L'imaghjini di fluorescenza sò stati acquistati cù un microscopiu di scanning laser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).Acquisite l'imaghjini Z-stack è creanu proiezioni di intensità massima secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
L'analisi di proliferazione di cellule HeLa hè stata realizata utilizendu Cell Counting Kit 8 (Dojindo) secondu l'istruzzioni di u fabricatore.
A crescita di E. coli DH5α hè stata analizata per mezu di a densità di cellula in cultura cù un spettrofotometru à 600 nm (OD600).
L'urganizazione citoscheletrica in e cellule transgeniche BY-2 hè stata osservata utilizendu un microscopiu di fluorescenza equipatu cù un dispositivu di scanning confocal CSU-X1 (Yokogawa) è una camera sCMOS (Zyla, Andor Technology).A densità citoscheletrica hè stata valutata da l'analisi di l'imaghjini, chì quantificava a percentuale di pixel citoscheletali trà i pixel citoplasmatici in l'imaghjini confocali utilizendu u software ImageJ cum'è descrittu38,39.
Per detectà a morte di e cellule in e cellule BY-2, una aliquota di a sospensjoni cellulare hè stata incubata cù 0,05% Evans blue per 10 minuti à a temperatura di l'ambienti.La colorazione selettiva di Evans blu di e cellule morte dipende da estrusione di colorante da cellule vitali da parte della membrana plasmatica intatta40.E cellule macchiate sò state osservate cù un microscopiu di campu luminoso (BX53, Olympus).
E cellule HeLa sò cultivate in DMEM supplementatu cù 10% FBS in un incubatore umidificatu à 37 ° C è 5% CO2.E cellule sò state trattate cù 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), o 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) per 6 h à 37 ° C.E cellule sò state fissate cù MetOH per 10 min è dopu cù acetate per 5 min à a temperatura di l'ambienti.I celi fissi sò stati incubati cù l'anticorpu primariu β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluitu in 0.5% BSA / PBS per 2 ore, lavatu 3 volte cù TBST, è poi incubatu cù Alexa Fluor capra anticorpu.488 1 ora.– Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) è 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) diluitu in 0,5% BSA/PBS.Dopu avè lavatu cù TBST trè volte, e cellule macchiate sò state osservate nantu à un microscopiu invertitu Nikon Eclipse Ti-E.L'imaghjini sò stati catturati cù una camera CCD Hamamatsu ORCA-R2 raffreddata cù u software MetaMorph (Dispositivi Moleculari).
Tempu di post: 17-ghjugnu-2024